Медицинская литература

Вирусы гриппа и грипп

Раздел: Медицина 

В. Р. ДАУДЛ и Г. С. ШИЛД (W. R. DOWDLE, G. С. SCHILD)

I. ВВЕДЕНИЕ

Впервые пассаж вируса гриппа в эксперименте был осуществлен в начале века при работе с ВЧП, однако до 1955 г. он не'был отнесен к вирусам гриппа (Schafer, 1955). В 1931 г. Shope пассировал «.классический» грипп на свиньях путем интраназального введения им фильтрата выделений из респираторных путей. Первые данные о заражении лабораторных животных вирусом гриппа человека были получены Smith и соавт. (1933). Авторы показали, что у хорьков, зараженных выделениями из респираторных путей человека, больных гриппом, развивалась респираторная инфекция, сопровождавшаяся лихорадкой и распространяющаяся среди них естественным путем. Эти результаты вскоре подтвердил Francis (1934). Затем было показано, что у мышей, 'которым иод наркозом вводили материал, взятый из носовых раковин больных хорьков, развивалась пневмония (Andrewes et al., 1934). Эти исследования привели к использованию лабораторных животных для определения инфекционности вируса и обеспечили быстрое накопление знаний о свойствах вирусов гриппа и иммунитета ,к этой инфекции.

Burnet (1940) обнаружил, что вирус 'гриппа может размножаться в «летках, выстилающих аллантоисную и амнио-тическую полости куриного эмбриона, что оказалось важным для изучения вирусов гриппа. Появилась возможность избежать неудобств, связанных с работой на лабораторных животных, а также возможность в больших количествах получить вирус гриппа в виде аллантоисной жидкости зараженных эмбрионов. Кроме того, стало 'возможным выделять вирус гриппа непосредственно «а эмбрионах, без предварительной адаптации его к хорькам или мышам, которая могла привести к случайному загрязнению вируса посторонними агентами. Открытие гемагглютинирующих свойств вирусных частиц (Hirst, 1941) также имело большое значение, поскольку обеспечило возможность обнаруживать  вирус без необходимости демонстрировать его инфекционные свойства. Следующим шагом, 'Имевшим очевидное значение для изучения репликации вируса гриппа, было культивирование вируса в культурах клеток (Mogabgab et al., 1954). Разработка систем бляшек в однослойных клеточных культурах для определения инфекционное™ вируса в конечном счете обеспечила возможность получения чистых клонов вируса гриппа для экспериментов по генетике.

II. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ

А. КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК

Введение вирусов гриппа А или В в (Культуру клеток вызывает один из трех эффектов: 1) вирус размножается с различной эффективностью, образуя инфекционное потомство (продуктивная инфекция); 2) вирус проходит неполный цикл репродукции с образованием неполного (вируса на поверхности клеток или неинфекционных вирусных частиц в среде (абортивная инфекция); 3) вирусу не удается инфицировать кленку. Некоторые экспериментальные данные (позволяют полагать, что .можно установить состояние хронической инфекции, при (котором небольшие количества инфекционного вируса выделяются в среду на протяжении длительного времени (иереистентная инфекция).

1. Продуктивная инфекция

Репликативный цикл вирусов гриппа детально описан

в гл. 8. За введением вируса <в 'культуру чувствительных кле

ток следует период «затмения» ^продолжительностью прибли

зительно 2 ч, в течение которого не обнаруживается каких-

либо 'биологических или серологических проявлений синтеза

вирусных белков. В течение этого периода идет синтез вирус-

специфических яолипептидов, :в том числе вирусслецифиче-

оких 'компонентов, которые не инкорпорируются в вирион.

Приблизительно через 2 ч после заражения в клетках можно

обнаружить антиген нуклешротеида (NP). Количество этого

компонента достигает максимума к 5—6-му часу после зара

жения. Присутствие гемагглютинина или поверхностных ан

тигенов в экстрактах клеток обнаруживается через 3 ч после

заражения. Почкующийся вирус может быть обнаружен на

оболочках клеток спустя приблизительно 5'/г ч после зара

жения. Вскоре после этого, примерно через 6 ч после зара

жения, начинается выход вируса в среду, и инфекционный

вирус' достигает максимальной .концентрации в среде через

7—8 ч после заражения

При заражении (вирусом гриппа человека различных первичных (культур клеток, полученных из тканей птиц или млекопитающих, в них (происходит продуктивный цикл. Перечень, этих культур можно найти у Hoyle (1968). Для того чтобы не повторять этот перечень, мы постараемся суммировать, наиболее существенные^ достижения, полученные рядом исследователей «а протяжении более 20 лет экспериментальной; работы.

Эпителиоидные клетки являются наиболее чувствительной, системой для культивирования in vitro обширного ряда штаммов вируса гриппа А и В. Чаще других используют для этих, целей почки плода человека (Mogabgab et al., 1954), макак резусов или зеленых мартышек (Mogabgab et al., 1961), почки телят (Haas, Wulff, 1957; Lehmann-Grube, 1965), свиней. (Lehmann-Grube, 1964), а также хомяков (Heath, Tyrrell,. 1959)'. Из них чаще используют первичные клетки почек, обезьян, человека и телят. Обычно предпочитают почки обезьян, что обусловлено скоростью «х роста и удобством в. обращении.

Не все культуры элителиоидных клеток пермиссивны для вируса (гриппа. Первичные диплоидные и гетероплоидные клетки человеческого амниона, так же как и другие (гетероплоидные эпителиальные клетки, обычно нечувствительны к нему. К гетероплоидным клеткам относятся такие линии, ясак HeLa, KB, клетки конъюнктивы (Green et al., 1957), а также MAF и клетки сердца и кишечника человека (Wong, Kilbour-ne, 1961).

Культуры эпителиощдных клеток, полученные из органов,, обладают более однородной чувствительностью к вирусам гриппа, чем культуры, полученные из органов эмбриона. По нашим данным, культуры клеток, приготовленные из почек, мертворожденных (Младенцев, столь же чувствительны к вирусам гриппа, как культура клеток почек обезьян, а культуры клеток эмбриональных почек человека менее чувствительны. Существенной проблемой при использовании эмбриональных почек человека является разница в чувствительности между различными партиями клеток. Почки обычно получают от эмбрионов разного возраста, условия их получения тоже варьируют, в результате чего сильно (колеблется процент жизнеспособных клеток. Эти факторы приводят к большому разнообразию в соотношении между эпителиоидными и фиб--робластоиодобными клетками в культурах почки эмбриона, человека. Это в свою очередь может привести к значительным вариациям в чувствительности    к вирусам.    Эпителиоидные клетки в отличие от фибробластоидных поддерживают репликацию вируса. Аналогичные данные отлучены в отношении клеток почек свиней. Культуры, полученные из почек взрослых свиней, состоят в основном из эпителиоидных «леток, которые поддерживают репликацию вируса гриппа. Культуры, полученные из эмбриональных почек, почти полностью представлены фиброблаетами и практически нечувствительны к вирусу (Lehmann-Grube, 1964). Эта закономерность имеет место у многих видов.

Чувствительность эпителиоидных клеток к гриппозной инфекции снижается при субкультивировании. В некоторых случаях, например при использовании «леток почки эмбриона человека, субпаосаж способствует пролиферации фибро-бластов, нечувствительных к вирусу. В других случаях, например при использовании почек обезьян (Dowdle, неопубликованные данные) и теленка (Lehmann-Grube, 1964), культуры клеток сохраняют свои эпителиоидные свойства при многочисленных пассажах, но спектр их чувствительности к вирусам меняется уже при первом субкультивировании. Ди-плоидность эпителиоидных (клеток сама по себе еще не определяет чувствительность к вирусам.

Некоторые вирусы могут размножаться или приобретать способность к размножению после адаптации в фиброблаетах или в гетероплоидных линиях клеток, но таких штаммов мало. Штамм NWS вируса гриппа A (iHONl) уникален по широте клеточного спектра; он может размножаться в гетероплоидных эпителиальных клетках (Wong, Kilbourne, 1961), в фибробластах (Kilbourne et al., 1964) и IB MDBK, гетеро-плоидной линии клеток бычьей почки (Choppin, 1969). Вирус гриппа В тоже способен размножаться в гетероплоидной линии, полученной из почек собак (Green, 1962).

Специфичность в отношении клетки-хозяина не всегда удается предсказать. Вирусы гриппа свиней не размножаются в культуре клеток почки человека (Hinz, Syverton, 1959), но вирусы гриппа человека хорошо размножаются в клетках почек свиней (Lehmann-Grube, 1964). Культура клеток почек обезьян нечувствительна к вирусам гриппа лошадей (Heq2Neq2) при заражении непосредственно клиническим материалом, но те же вирусы размножаются в клетках почки обезьян после одного пассажа на куриных эмбрионах (Dowdle et al., 1963).

Недостаточно полное устранение сывороточных компонентов перед инокуляцией вируса является одной из главных лричин выделения вируса в малом проценте случаев и получения низких инфекционных титров в чувствительных культурах клеток. Компоненты сыворотки, представляющие собой необходимую составную часть среды для роста клеток, могут неспецифически  нейтрализовать  вирус.     Это в  наибольшей

степени касается вирусов, выделенных после 1957 г. Ингиби-рующее действие сыворотки может быть устранено посредством двукратной или многократной отмывки клеток средой, .не содержащей сыворотки.

2. Абортивная инфекция

Henle и соавт. (1955) первыми показали, что клетки HeLa (из карциномы шейки матки человека), зараженные при большой множественности размноженным на куриных эмбрионах вирусом, продуцируют неинфекционные гемагглю-тинирующие частицы. Абортивная инфекция наблюдается и в клетках L, зараженных FPV (Franklin, Breitenfeld, 1959), а также в различных линиях клеток, зараженных вирусом гриппа свиней (Wong, Kilbourne, 1961), ъ клетках аецитной опухоли Krebs-2 (Low et al:, 1962), в клетках ВНК-21 (Fra-ser, 1967) и в клетках BSC-1 (Nikitin et al., 1972). Абортивная инфекция наблюдается не только в гетероплоидных клетках, но также и в диплоидных фибробластах человека (Kilbourne et al., 1964).

Механизм абортивной инфекции не вполне ясен; вероятно, блокируется какая-то стадия цикла репродукции вируса. В опытах по изучению неполных циклов репродукции вируса гриппа в клетках HeLa (Henle et al., 1955) или в клетках L (Franklin, Breitenfeld, 1959) было отмечено образование значительного количества как NP-антигена, так и гемагглюти-нирующих частиц. Loffer и соавт. (1962) показали, что при абортивной инфекции в клетках HeLa NP накапливается в ядре, а освобождающиеся вирусные частицы не содержат полной последовательности нуклеотидов вирусной РНК. Choppin и Pons (1970) обнаружили, что в этих гемагглюти-нирующих неинфекционных частицах отсутствует самый большой из 'фрагментов вирусной РНК, но имеется повышенное количество малых фрагментов РНК- Эти авторы также нашля, что клетки HeLa могут продуцировать инфекционный вирус, если в инокуляте отсутствует неполный вирус. В этом отношении абортивная инфекция в клетках HeLa сходна с классическим феноменам фон-Mairayea, т. е. с продукцией неполного вируса в куриных эмбрионах.

3. Персистентная инфекция

Ряд экспериментальных данных позволяет предполагать возможность хронической инфекция, сопровождаемой низким выходом вируса, вызываемой вирусами гриппа в культурах тканей. Tyrrell (1959) описал хроническую инфекцию культуры клеток почки телят вирусом WS. Гаврилов и соавт. (1972) обнаружили, что три пассировании жлеток почек сви-

ней, зараженных вирусом WSN, вирус мог быть обнаружен на протяжении 105 дней. Willinson и Barland (1972) показали персистенцию вируса P.JR8 на протяжении 50 дней после заражения им культуры «леток легкого человека. В культуре не развивался цитоиатический эффект, а в культуральной жидкости обнаруживались небольшие количества инфекционного вируса. Такие сообщения показывают, что по крайней мере некоторые штаммы вируса гриппа могут вызывать развитие кратковременной хронической инфекции, но «настоящая» персистентная инфекция с вирусом гриппа еще не продемонстрирована.

4. Параметры инфекции

а) Вирусспецифические компоненты в клетке. Метод, флюоресцирующих антител (ФА), 'предложенный Weller и Coons (1954), широко использовали в качестве иммунологического теста для 'идентификации и локализации вирусспеци-фических антигенов в зараженных 'клетках. Прямые и непрямые методы иммунофлюоресценции в применении к вирусам были детально описаны в обзоре Liu (1969). Раньше других этот метод применили к вирусу гриппа Watson <и Coons (1954), а также Liu (1955), показавшие преимущественно ядерную локализацию флюоресценции, обусловленную NP-ан-тигеном в зараженных вирусом гриппа клетках. Впоследствии этот метод широко использовался при изучении распределения антигенов вируса гриппа в разные сроки цикла репродукции вируса. Маепо и Kilbourne (1970) описали распределение NP, гемагглютинина и нейраминидазы. Oxford и Schild (1974) изучили распределение всех четырех главных антигенов вируса, в том числе М-белка.

Попытки титрования вируса гриппа в культуре клеток с использованием техники флуоресцирующих антител были предприняты Oxford и Schild (1968), описавшими методику" подсчета инфекционных центров для оценки количества флюоресцирующих клеток.

Dimmock (1969) обнаружил-присутствие вирусспецифиче-скаго антигена в ядрышках клеток, зараженных вирусом гриппа. Антиген может (быть обнаружен с помощью метода ФА при использовании сывороток зараженных мышей, но несывороток, приготовленных против вирусных частиц. Флюоресценция в ядрышках появлялась в ранних стадиях инфекции и была, по мнению автора, обусловлена вирусным антигеном, накапливающимся В' зараженных клетках, но не включающимся в вирусные частицы.

Метод ФА весьма чувствителен 'И позволяет определять,

малые .количества антигена или антител, но он может давать

неспецифическое окрашивание, поэтому контрольные препа

раты строго обязательны. Для обнаружения определенных:

антигенов необходимо попользовать высокоспецифичеокие антисыворотки, полученные путем иммунизации очищенными .антигенами.

Техника радиоактивной метки широко применялась для обнаружения внутриклеточных вирусных белков при репродукции вируса гриппа. Becht (1969) использовал метку радиоактивными предшественниками и авторадиографию для того, чтобы показать преимущественно ядерную локализацию NP. Другие авторы '(Joss et al., 1969; Taylor et al., 1969; Ske-hel, 1972) использовали радиоактивную метку и ПААГЭ. Эти исследования будут подробно описаны далее, а здесь о них будет лишь упомянуто. Одним из наиболее результативных методов было применение 358-метионина, который эффективно включается в вирусные белки. Skehel (1972), применив этот метод, обнаружил синтез 9 полипептидов в клетках, зараженных вирусом гриппа. Семь из них соответствуют известным структурным полипептидам вируса. Два полипептида (8 и 9) не могут быть отождествлены со структурными компонентами вируса; они были сочтены вирусзакодированными продуктами, не включающимися в вирусные частицы. Эти компоненты обнаруживаются вскоре после заражения (Skehel, 1973), но их значение для инфекционного процесса неизвестно.

Такие методы, как метка иммуноферритивом с последующей электронной микроскопией, не дали существенных результатов при попытках идентификации внутриклеточных антигенов в клетках, зараженных вирусом гриппа. Одним из главных препятствий здесь было неелецифическое связывание иммуноферритина с белками кленки. Эти методы, однако, были успешно использова'ны для идентификации вирусных антигенов на поверхности клетки.

б) Вирусные компоненты на поверхности клетки. Техника гемадсорбции (Had), предложенная Vogel и Shelokov (1957), является чувствительной для обнаружения гемагглютинина на поверхности инфицированной клетки. При этом методе эритроциты морских свинок, цыплят или человека вносят в инфицированную культуру клеток, которую затем промывают и инкубируют в среде, не содержащей сыворотки. Наличие вируса определяют по присутствию групп эритроцитов, связанных на поверхности клеточного слоя. Следует использовать такие эритроциты, которые агглютинируются данным вирусом. Наиболее широко для (гемадсорбции использовали культуру клеток почек обезьян и телят. Культура клеток куриного эмбриона может быть применена для некоторых штаммов вирусов хрипла типа А птиц. Had является полезным и чувствительным методом для обнаружения вирусной инфекции, но следует иметь в виду ;возможность контаминации культур темагглютинирующими агентами, например воз-

можность присутствия вируса SV5 в культуре клеток почек обезьян. Кроме того, старые эритроциты неспецифически адсорбируются на клетках почек в культуре (Dowdle, Robinson, 1966). Had широко применяется в качестве метода титрования инфекционности вируса гриппа. Следует отметить, что штаммы, проходящие неполный цикл репликации, в некоторых клетках хозяина могут тем ее 'Менее вызывать Had в этих культурах.

Синтетический хромогенный субстрат нейраминидазы 2- (3-метокеифенил) -N-ацетилнейраминовая кислота (MPN) (Tuppy, Palese, 1969) нашел применение для определения активности нейраминидазы в культуре при репликации вируса гриппа. Palese и соавт. (1970) удалось идентифицировать фокусы размножения вируса в однослойной культуре с помощью добавления MPN я диазониевой соли 4-амино-2,5-ди-метокси-4/-нитроазО'бенз.ала. Эти фокусы окрашивались в красный цвет, поскольку 3-метоксифенол, освобождаемый из MPN под действием NA*, реагировал с диазониевой солью, давая красное окрашивание. Фокусы активности NA*, т. е. очаги размножения вируса, могли быть обнаружены этим методом даже при отсутствии локального цитопатического эффекта.

Этот метод может быть использован при изучении генетики. Palese и Schulman (1974) с помощью MPN-хромофорного метода идентифицировали два типа инфекционных очагов в однослойной культуре линии клеток 'Конъюнктивы человека, зараженной клонированным рекомбинантом вируса гриппа. Были обнаружены ярко и слабоокрашенные участки, соответствующие двум генетически различным компонентам вирусной популяции, имеющим соответственно высокое и низкое соотношение активностей NA* и НА*.

Метод ФА нередко используется для обнаружения антигенов вируса гриппа на поверхности /клеток. Необходимо, чтобы при этом оболочка клетки не повреждалась, что предотвращает проникновение в клетку реагентов. Rutter и Mannweiler (1973) описали появление вирусспецифических антигенных детерминант на (поверхности клеток HeLa, зараженных вирусом гриппа; при этом использовали непрямую иммунофлюоресценцию и нефиксированные клетки. Флюоресценцию обнаружив а ля на поверхности клеток через 4 ч; после заражения; через 8 ч она достигала максимума. Oxford (личное сообщение) обнаружил интенсивное свечение на поверхности зараженных клеток MDBK и первичной культуры клеток почки теленка при использовании антисывороток против очищенных NA* и НА*. На основании полученных данных невозможно было с достоверностью говорить о различном распределении этих антигенов на поверхности клетки, хотя флюоресценция при использовании сыворотки: против темаглютинина была сильнее, чем при использовании антинейра-минидазной сыворотки, что, видимо, указывает на большее количество НА на поверхности клетки по сравнению с количеством NA. Хотя Rutter и Mannweiler обнаружили «полярное» скопление антигенов вируса гриппа на одной стороне клетки, в опытах Oxford ;и НА* и NA* были распределены равномерно.

Для определения антигенов вируса гриппа на поверхности зараженных клеток с помощью электронной микроскопии Morgan и соавт. (1961) использовали иммуноферритиновый метод с применением противогриппозной сыворотки, конъюги-рованной с ферритином. Подобные методы можно применять и для специфической цдентификации антигенов на поверхности клеток при использовании антисывороток против очищенных вирусных антигенов: НА*, NA*, NP и белка мембраны..

в) Вирусные компоненты, освобождаемые из клеток. Освобождение синтезированных вирусных частиц с поверхности зараженных клеток осуществляется путем «почкования» на: протяжении длительного периода, начиная с 5—6-го часа после заражения. Зараженные клетки постепенно дегенерируют с развитием цитопатических изменений. Помимо вирусных частиц, в культуральную среду может выходить и «растворимый» Р-антиген. За выходом вируса и «растворимого» антигена можно следить, определяя наличие вирусспецифических компонентов в культур ал ьной жидкости но биологической активности, или по присутствию вирусепецифических антигенов. Чаще всего для определения динамики выхода вируса из клеток используют тест гемагглютинации (Hirst, 1941). Определение активности NA* применяют для этой щели лишь в тех случаях, когда ставится специальная задача. Оба этих.теста позволяют определить главным образом наличие вирусных частиц. Связывание комплемента (РСК) часто применяют для обнаружения вирусного антигена в культур а ль-ной жидкости, причем используют антитела к NP или антитела к поверхностным антигенам (У-антисыворотки). Могут быть использованы и антисыворотки к очищенным гемагглю-тинину и нейраминидазе. Ори этом обнаруживаются как вирусные частицы, так и свободные поверхностные антигены, в то врехМЯ как при использовании антител ок белкам NP я М выявляются в основнОхМ «растворимые» антигены, а не вирусные частицы. Характеристика етих систем при определении биологических свойств вируса и количественном измерении гриппозных антигенов описана в гл. 12.

Инфекционные вирусные частицы обнаруживают с помощью того или иного метода титрования инфекционности. Чаще всего применяют наиболее чувствительный метод определения конечной точки титрования «а куриных эмбрионах.. Заражение куриных эмбрионов описано в разделе II, Г этой

главы. Инфекционную 50% дозу для эмбрионов (ЭИД50) рассчитывают по количеству эмбрионов, зараженных три инокуляции каждого разведения, по обычной формуле (Reed, Muench, 1938). Титры выражаются в ЭИД50 на 1 мл жидкости. Титрование инфекционности можно проводить с использованием метода культивирования фрагментов хорион-аллантоисвой оболочки на скорлупе (Fazekas de St. Groth, White, 1958), который описан далее, однако этот метод менее чувствителен, чем титрование на эмбрионах. Титрование вируса можно также проводить в культуре клеток способом, аналогичным титрованию на эмбрионах, но с определением инфицирования культуры по гемадсорбции, как описано ранее.

Цитопатический эффект редко 'используется в качестве показателя заражения культуры вирусом гриппа. Эти эффекты (Pereira, 1961) варьируют в широких пределах у разных штаммов и на различных культурах. Поскольку они имеют обычно характер дегенеративных изменений с грануляцией цитоплазмы, вакуолизацией, пикнозом ядер, сморщиванием и дезинтеграцией клеток, конечная точка титрования не может быть определена с точностью. Описаны базофильные ци-топлазматические включения в клетках, зараженных вирусом гриппа А, но они тоже варьируют (Soloviev, Alekseeva, 1960). Базофильные цитоплазм а тичес<кие включения часто наблюдаются также в «летках, зараженных некоторыми штаммами вируса гриппа В (Porebska et al., 1968).

Для некоторых вирусов гриппа, как, например для FPV или для нейротронных вариантов человеческих штаммов NWS и WSN, определение инфекционности может быть осуществлено подсчетам бляшек в монослойной культуре клеток с использованием какой-либо из методик, описанных в разделе ИВ. При использовании метода бляшек можно знать его чувствительность по отношению к титрованию на эмбрионах. Для перечисленных выше штаммов это соотношение приблизительно равно 1 : 1, но для большинства штаммов, выделенных у человека, и для большинства используемых для бляшек систем относительная чувствительность низка.

Б. МЕТОД НЕГАТИВНЫХ КОЛОНИИ [БЛЯШКИ]

Способность вирусов гриппа к образованию бляшек широко варьирует. Многие вирусы не образуют бляшек, а те, которые образуют, имеют весьма низкую эффективность бляш-кообразования, в особенности вирусы гриппа А. Способность к образованию бляшек есть индивидуальный признак штамма вне зависимости от принадлежности к тому -или иному серотипу.

Было описано образование бляшек в первичных культурах фибробластов   (Simpson, Hirst,   1961), легких   (Granoff,1955) и почек (Wright, Sagik, 1958) журиносго эмбриона. Фиб-робласты куриного эмбриона успешно использовались главным образом в работе с нейротропным штаммом NWS и с несколькими многократно пассированными лабораторными штаммами вирусов гриппа типов А и В. Наоборот, клетка почек куриного эмбриона является неплохой системой для получения бляшек со многими штаммами вирусов гриппа типа A (Beare, Keast, 1974).

Образование бляшек некоторыми вирусами гриппа А и В в монослое клеток куриного эмбриона можно усилить обработкой клеток ферментами: панкреатином (Came et al., 1968) или трипсином (Tobita, Kjlbourne, 1974). Механизм действия этих протеолитичеоких ферментов неясен. Возможно, что они модифицируют поверхность клетки, делая ее более чувствительной к адсорбции и проникновению вируса,, или же разрушают какой-то ингибирующий фактор, ассоциированный с клеткой или остающийся после удаления среды роста, содержащей сыворотку.

Клетки почак сирийского хомяка были описаны в качестве системы, высокочувствительной к вирусам гриппа А (Grossberg, 1964), причем вирусы образовывали бляшки без 'предварительной адаптации. В дальнейшем, однако, о каких-либо опытах, проведенных с этими клетками, не сообщалось,

Две системы наиболее широко применялись для бляшко-образования с разными вирусами .гриппа: первичные культуры клеток почек обезьян и бычьих почак. 'Большинство штаммов вирусов гриппа типов А и В, выделенных и пассированных на других хозяевах, не образуют бляшек на клетках почек обезьян, однако многие штаммы могут 'быть адаптированы и начинают образовывать бляшки после нескольких пассажей (Henry, Youngner, 1957; Choppin, 1962). Было высказано предположение (Takemoto, Fabish, 1963), что неэффективное бляшкообразование вирусами гриппа типа А обусловлено торможением адсорбции вируса на клетках, вызываемым сульфатированными полисахаридами агара. У некоторых штаммов количество и размер бляшек значительно увеличи-. вались при добавлении ДЗАЭ-декстрана в агар для связывания ингибиторов. Этот ингредиент сейчас используется как: составная часть агарового слоя в большинстве систем.

Клетки почек теленка, как отмечал еще Lehmann-Grube:

(1963) и недавно подтвердили Веаге и Keast (1974), являют

ся высокоэффективной системой для бляшкообразования, вы

зываемого вирусом гриппа В. Однородность результатов,

полученных с разными штаммами гриппа В, контрастирует

с широко варьирующими результатами, получаемыми с раз

ными штаммами вирусов гриппа А. О необходимости адап

тации вируса гриппа А для получения бляшек в культуре

бычьих почек достоверных данных нет.

Из этих двух культур клетки 'почек обезьян обладают лучшими качествами в отношении роста и способности переносить лабораторные .манипуляции. Клетки 'бычьих почек хорошо растут, wo легко отделяются от стекла после образования 'ОПЛОШНОГО МОНОСЛОЯ.

Все первичные культуры «леток имеют общий недостаток — они неоднородны по составу и, -кроме того, чувствительность к вирусам может сильно 'различаться в культурах, полученных от разных особей. Некоторые клетки (в особенности «летки почек обезьян и бычьих почек) нередко оказываются жонтаминированнымипосторонними агентами. В 'принципе эти препятствия могут быть устранены при работе с ге-тероплоидной линией клеток. Вариант Wong—Kilbourne линии клеток Чанга (клетки конъюнктивы человека) был успешно использован для бляшкообразования с вирусами гриппа А и В ((Sugiura, Kilbourne, 1965). На клетках этой линии образуют бляшки и штаммы вируса гриппа типа A (H3N2) из клинического материала (Rytel, Sedmak, 1973). Хотя пассаж через гетероплоидную линию клеток делает вирус непригодным для изучения на людях или для живой вакцины, эти данные имеют существенное значение для генетических исследований и серологических тестов.

В. ОРГАННЫЕ КУЛЬТУРЫ

Однослойные и суспензионные культуры состоят из недифференцированных клеток и поэтому редко сохраняют спектр 'Чувствительности к вирусам, характерный для того органа, из которого они 'получены. Органные культуры представляют собой кусочки органов эмбриона или взрослого животного, поддерживаемые in vitro без пролиферации клеток и сохраняющие поэтому тот спектр чувствительности к вирусам, который данный орган имеет in vivo. ,По этой причине органные культуры оказываются весьма полезными системами для изучения in vitro взаимодействия между вирусом и чувствительными клетками хозяина.

Наиболее обширные исследования с 'использованием разных органных .культур, полученных от одного и того же вида животных (хорек), описаны в сообщениях Basarab и Smith (1969, 1970), Gould и соавт. (1972), Toms и со авт. (1974). Органные -культуры носовых раковин, мочевого пузыря, матки, трахеи, легких, конъюнктивы, яйцевода и пищевода обладали убывающей в этом порядке чувствительностью к вирусу гриппа A (H2N2), выращенному m куриных эмбрионах. Ткани пищеварительного тракта были нечувствительны, за исключением пищевода и глотки, которые могли быть заражены при использовании высокой дозы заражения. Нечувствительными оказались также мышечная, 'ретикулоэндотелиальная ткань, кровеносные сосуды и почка. В опытах, поставленных in vivo, при интраназальном заражении удавалось инфицировать только носовые раковины, легкие, трахею и пищевод, причем большая часть обнаруживаемого вируса содержалась в носовых раковинах. Мочевой пузырь и матка не были инфицированы, хотя, как было показано ранее, органные культуры этих тканей чувствительны к вирусу в такой же степени, <как и 'респираторные ткани. Оба этих органа могут -быть инфицированы при прямой урогенитальной инокуляции вируса (Basarab, Smith, 1970). Заражение урогенитальных тканей вирусом гриппа возможно не только у хорька. Rostoczy я соавт. (1973) обнаружили, что вирус гриппа типа А способен размножаться и в органной культуре эмбрионального эндометрия человека.

Поскольку ткани респираторного тракта являются главным 'местом размножения вируса in vivo, органные культуры, полученные из этих тканей, привлекали наибольшее внимание исследователей. Фрагменты слизистой с реснитчатым эпителием, полученные из трахеи и носовой полости ряда животных, оказались способными поддерживать весьма активную репликацию вируса гриппа; к фрагментам легочной ткани это относится в меньшей степени. Обсуждение использования органных культур для размножения вируса и перечисление использованных культур можно найти в обзоре Ноогп и Tyrrell (1969). Методы приготовления органных культур описаны там же, а также Cherry и Taylor-Robinson (1970).

Данные по оценке 'эффективности клеток реснитчатого эпителия для выделения вирусов гриппа весьма немногочисленны. В тех ограниченных исследованиях, которые проводились в этом направлении, не обнаружено заметных преимуществ органной культуры трахеи эмбриона человека перед первичной культурой почек макак резусов для выделения вирусов гриппа A (Roome et al., 1971) или В (Votava, Tyrrell, 1970). Кроме того, культуру трахеи человека труднее получать и она менее удобна в обращении, чем обычные культуры клеток.

Было проведено сравнение органных культур трахеи куриного эмбриона с первичной культурой клеток почки зеленой мартышки для выделения вируса гриппа A (Blascovic et al., 1972b). Приблизительно одинаковое число штаммов было выделено в каждой системе, так же как в обеих системах. Авторы предложили использовать обе системы для выделения максимального количества штаммов. Использование органной культуры трахеи куриного эмбриона не сравнивали с обычным заражением куриных эмбрионов, которое несравненно проще.

Поскольку чувствительность тканей к вирусам в органных культурах подобна таковой в интактном организме, по-

лагают, что и действие противовирусных веществ должно быть сходным. Если это так, то органные культуры должны оказаться полезными для оценки действия противовирусных препаратов. Здесь, однако, имеются как положительные, так и отрицательные стороны. 'С одной стороны, фрагмент органа, удаленный из организма, не подвергается нормальной физиологической регуляции, что может отразиться на эффективности препарата. С другой стороны, концентрация препарата и продолжительность контакта могут лучше контролироваться в органных культурах. Tyrrell и соавт. (1965) первыми использовали реснитчатый эпителий человека в органной культуре для оценки in vitro действия противогриппозного препарата (амантадин). Herbst-Laier (1970) исследовал широкий круг органных культур, включая эксплантаты трахеи мышей, хомяков, хорьков, крыс, собак, обезьян, свиней « телят, а также носовых раковин собак и хорьков. Из них наиболее пригодными для оценки размножения (и его подавления) прототипных штаммов вирусов типов А и В оказались органные культуры трахеи собак и хорьков. В культуре трахеи собак обнаруживались специфические гистологические изменения, которые автор рассматривает как более надежный критерий оценки, чем титр вируса как таковой. Характерные и постоянные цитопатические изменения были также обнаружены Blascovic и соавт. (1972а) в органных культурах трахеи куриного эмбриона, зараженных вирусом гриппа А (Гонконг/68); это позволяет полагать, что и данная культура может оказаться полезной.

Использование органных культур реснитчатого эпителия было предложено для определения спектра хозяев вновь выделенных штаммов вируса гриппа A. Schmidt и соавт. (1974) сообщили, что при заражении таких культур, полученных из органов кур, лошадей, хорьков и свиней, вирусами, выделенными 'у. людей, свиней лошадей и птиц, чувствительность культур коррелировала с пассированием штамма в том или ином хозяине в природных условиях.

Органные культуры могут быть использованы и для отбора штаммов-кандидатов для получения живых вакцин. Mos-tow и Tyrrell (1973) описали определенную корреляцию меж-'ду способностью вируса снижать подвижность ресничек эпителия и повреждать клетми в органной культуре трахеи эмбриона человека и его способностью вызывать заболевание у людей. Эта корреляция, однако, не наблюдалась с органными культурами хорьков и не распространялась на все штаммы вирусов гриппа (Нага et al., 1974). Вирусы гриппа типа В обнаружили одинаковую патогенность для органных культур трахеи человека при различной вирулентности для людей. Поэтому представляется очевидным, что, хотя органные культуры имеют много достоинств для вирусологических

исследовании, нельзя считать, что орган, разрезанный на кусачки и поддерживаемый вне организма в искусственной среде, реагирует на инфекцию точно так же, как в интактном организме.

Г. КУРИНЫЙ ЭМБРИОН

Куриные эмбрионы широко используются для выделения и размножения вируса еще со времени первого описания заражения в полость амниона (Burnet, 1940). Классическая работа Beveridge и Burnet по культивированию вирусов и рик-кетсий в курином эмбрионе была опубликована в 1946 г. С тех пор почти не было получено существенных дополняющих данных.

Некоторые ранние рекомендации сейчас выглядят, однако, устаревшими в связи с биологической изменчивостью вирусов гриппа. В 40чх тодах для выделения вирусов гриппа типов А и В рекомендовалось заражение 13—14-дневных эмбрионов в полость амниона, а для адаптированных в лаборатории штаммов — заражение в полость аллантоиса 10— 12-дневных эмбрионов. Вплоть до 1968 г. выделение вирусов гриппа А и В можно было осуществить, как правило, лишь посредством заражения в полость амниона и для успешной адаптации требовалось много пассажей. Очень редко выделяли штамм путем заражения в полость аллантоиса. С 1968 г. человеческие штаммы вируса гриппа А выделяются с одинаковой легкостью при обоих путях заражения: введение материала в полость амниона не дает никаких преимуществ. В отношении вируса гриппа типа В на протяжении многих лет тоже можно наблюдать изменения. Поскольку трудно предсказать заранее предрасположение штамма того или другого вируса к размножению при определенном способе введения, в качестве стандартной процедуры рекомендуется заражение 11-дневных эмбрионов в полость как амниона, так и аллантоиса.

Неадаптированные вирусы, введенные в амнион 13-дневных эмбрионов, размножаются первоначально в трахее и легких. Они могут вызывать гибель эмбриона, но могут и не вызывать ее .Вирусы, многократно пассированные этим путем, размножаются в амниотической оболочке и эпителиальных покровах эмбриона, а также в респираторных путях, вызывая множественные кровоизлияния и быструю гибель его. После нескольких пассажей штамм приобретает способность размножаться при заражении в полость аллантоиса.

Штаммы, не адаптированные к куриному эмбриону (фаза О—от original, т. е. исходная), нередко дают более высокие титры гемагглютинина с эритроцитами морской свинки или человека, чем с куриными эритроцитами. 'После адаптации  (фаза D — от derived, т. е. производное)   вирус обычно

агглютинирует куриные эритроциты до тех же титров, что эритроциты млекопитающих. Этот переход из фазы О в фазу D (Burnet, Bull, 1943) наблюдается не 'всегда. Большинство штаммов вирусов гриппа А и В, выделенных после 1968 г., агглютинируют эритроциты морокой свинки и куриные эритроциты до одинаковых титров.

Адаптированные вирусы, введенные в полость аллантоиса Подневного куриного эмбриона, размножаются предже всего в энтодермальных -клетках хорион-аллантоисной оболочки, хотя вирус можно обнаружить также в клетках амниотиче-ской оболочки и респираторных путей.

Накопление вируса в полости аллантоиса имеет очевидные преимущества, поскольку получается большой объем вирусеодержащего материала и его легко собирать. Хорошо адаптированные штаммы могут давать 109—1011 вирусных частиц на 1 мл. Вирус одинаково хорошо размножается в эмбрионах от 10- до 13-дневното возраста, но объем аллан-тоиеной жидкости резко уменьшается, начиная с 13-го дня. Кроме того, у эмбрионов 'более раннего возраста содержится меньше солей мочевой кислоты ш аллантоисной жидкости; по мере развития эмбриона их содержание нарастает. Эмбрионы, зараженные в 12—'13-дневном возрасте, содержат аллантоисную жидкость, которая мутнеет сразу после охлаждения; за несколько дней в ней образуется обильный осадок. Осадки -солей мочевой кислоты содержат вирус и их образование может резко снижать титр вируса в жидкости.

Величина заражающей дозы вируса -может существенно влиять на его урожай. Рекомендуется использовать дозы от 104 до Ю5 ЭИД50 на 1 мл. При использовании более низкой дозы урожай вируса может быть низким, а динамика репродукции— неравномерной. Более высокие заражающие дозы могут вести ,к снижению урожая (Miller, 1944). При этом может также развиваться эффект фон Магнуса (von Magnus, 1952), т. е. увеличение отношения неинфекционных частиц <к инфекционным. Этот феномен обсуждается в гл. 1.

Для некоторых специальных исследований может оказаться необходимым культивирование (вируса в клетках оболочки аллантоиса без репродукции вируса в других тканях эмбриона. Для'таких исследований могут использоваться .деэмбрио-нированные яйца (Bernkoff, 1949). Однако урожай вируса в них гораздо ниже, чем в ннтактных эмбрионах, и этот метод не может быть рекомендован для постоянного использования.

Д. ФРАГМЕНТЫ ХОРИОН-АЛЛАНТОИСНОЙ ОБОЛОЧКИ НА ЯИЧНОЙ СКОРЛУПЕ

Поскольку эксперименты, требующие заражения большого числа куриных эмбрионов, дороги и трудоемки, преимущества техники, позволяющей провести такой же опыт с исполь-

зованием фрагментов одного яйца, очевидны. При этом достигается и однородность ткани, поскольку снимается проблема неодинаковой чувствительности разных эмбрионов к вирусу.

Fulton и Armitage (1951) первыми предложили способ разрезания хорион-аллантоисной оболочки (ХАО) на маленькие кусочки и их поддержания в чашках на пластиковых досках, но титры вируса при этом (были значительно ниже, чем в интактном эмбрионе. Fazekas de St. Groth и White (1958) улучшили методику, изменив среду и использовав кусочки, не отделенные от скорлупы. (При этом скорлупа забу-феривала среду и служила опорой для ткани; экспонировалась максимальная поверхность, причем только та сторона оболочки, которая чувствительна к вирусной инфекции. Инфекционные титры большинства штаммов гриппа А в такой системе не уступают титрам :в интактном эмбрионе. Размножение вируса гриппа В шло менее успешно. Эта методика особенно удобна для титрования инфекционности и для реакции нейтрализации с вирусом гриппа А, а также для быстрого выделения и клонирования рекомбинантов вирусов гриппа A (Webster, 1970).

Ш. КРУГ ХОЗЯЕВ СРЕДИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

А. ХОРЬКИ

Вирус гриппа человека А был впервые выделен на хорьках (Smith et al., 1933). С тех лор хорькам уделяли много внимания, сначала как средству выделения вируса, а позднее как модели для изучения патогенности и иммунологии гриппа.

Хорьки высоковосприимчивы к заражению вирусами гриппа типа А. Интраназальное введение инфекционного вируса вызывает через 48 ч температурную реакцию, которая может длиться от 24 до 72 ч. У животных в этот период развиваются симптомы гриппа: ринит, чиханье, насморк, потеря аппетита, вялость. Вирус выделяется во внешнюю среду на протяжении первых дней заболевания и легко может передаваться незараженным хорькам и людям (Smith, Stuart-Harris, 1936). Хорьки могут заражаться от человека естественным путем при контакте, поэтому при экспериментальном заражении следует заранее убедиться ш отсутствии у них антител к циркулирующим среди людей вирусам гриппа.

Сообщалось, что хорьки были высокочувствительны к вирусам гриппа А, преобладавшим в середине 30-х годов, но менее чувствительны к более поздним штаммам НО, к штаммам HI  и к вирусу гриппа  В   (Hirst,  1947b;  Sugg, Nagaki,1955). Возможно, что это действительно так, но сколько-нибудь систематических исследований по использованию хорьков для выделения вирусов А и В не проводилось после начала 40-х годов. К тому времени техника использования куриных эмбрионов получила широкое распространение, и, естественно, применение, хорьков для выделения вируса 'вышло из употребления.

Хорьки, однако, остаются широко используемой моделью для изучения гриппа человека. Картина заболевания у хорьков весьма сходна с таковой у человека (Shope, 1934, Francis, Stuart-Harris, 1938; Liu, 1955; Sugg, Nagaki, 1955; Haff et al., 1966). Разные штаммы вирусов гриппа вызывают широкий спектр аслинических проявлений болезни. Реакция на заражение варьирует от лепкой бестемпературной респираторной инфекции с очаговыми гистологическими изменениями в передней части носовых ходов (Haff et al., 1966) до острой температурной реакции с быстрым развитием некроза и отторжением клеток реснитчатого эпителия (Shope, 1934; Francis, Stuart-Harris, 1938) и даже до вирусной пневмонии с .разрушением клеток, выстилающих альвеолы (Hers, 1963; Mulder, Hers, 1972). Ранее с помощью световой микроскопии ^полученные данные о вирусопецифичееких патологических изменениях эпителия дыхательных путей были позднее подтверждены электронно-микроскопическими исследованиями (Hotz, Bang, 1957) и методом флюоресцирующих антител (Liu, 1955).

При интраназальном заражении вирус размножается в носовых раковинах, легких, трахее, пищеводе (Haff et al., 1966; Basarab, Smith, 1969). Вирус обнаруживался только в этих тканях, хотя другие (мочевой пузырь, матка, конъюнктива) тоже восприимчивы ж нему. Преимущественное размножение вируса в тканях респираторных органов наблюдается даже при внутривенном или внутрисердечном введении вируса (Basarab, Smith, 1969). Преимущественное заражение именно респираторной ткани было также подтверждено Barber и Small (1974) в опыте, при котором сформированная хирургическим путем сумка из ткани трахеи пересаживалась под кожу. Вирус поражал как трахею, так и имплантированную ткань трахеи независимо от пути заражения. Пассивная иммунизация сывороткой хорьков, содержавшей антитела против вируса, не предотвращала распространение вируса гематогенным путем.

Заражение хорьков вирусом гриппа к повышению содержания белка и кратковременному появлению нейтрализующих антител в смывах из носа, <а также к быстрому подъему уровня нейтрализующих антител IB сыворотке. После выздоровления хорьки иммунны к повторному заражению гомологичным вирусом   (Smith  et al.,   1933;  Francis,  Stuart-Harris,

1938; Haff et al., 1966; Marois et al., 1971). Поскольку это весьма близко напоминает реакцию на заражение у человека, возобновился интерес к удобной модели для изучения иммунитета и методов иммунизации. Potter et al. (1972a, b) и Potter (1973) в серии сообщений описали отсутствие защитного эффекта при внутримышечном введении водной инактивиро-ванной вакцины. Иммунизация с использованием адъюванта обеспечивает некоторую степень защиты и вызывает подъем уровня антигем-агглютининов в сыворотке, но иммунитет при этом не столь выражен, как после перенесенного заболевания. Это в общем соответствует данным, полученным на людях, и позволяет полагать, что отсутствие полного иммунитета при использовании убитой вакцины обусловлено ее неспособностью вызывать появление антител в секрете слизистой оболочки носа. Антитела в смывах из носа постоянно обнаруживаются при естественном заболевании  (Haff,  1973).

Б. ГРЫЗУНЫ

Белые швейцарские линии мышей использовались как лабораторная (модель для изучения вирусов гриппа человека на протяжении 40 лет (Andrewes et al., 1934; Francis, 1934). Преимущества использования мышей очевидны: малые размеры и низкая стоимость допускают такие лабораторные исследования, которые были бы невозможны при использовании более крупных и дорогих животных, например хорьков.

В отличие от хорьков мыши не обладают высокой восприимчивостью к вирусу гриппа. Интраназалыное введение инфекционного материала от больных людей не вызывает выраженной картины заболевания у мышей, хотя вирус может размножаться в легких, бронхиолах, трахее и, в меньшей степени, тканях носовой полости (Hirst, 1947a; Lida, Bang, 1963; Mulder, Hers, 1972). Поскольку размножение вируса может быть засвидетельствовано лишь посредством титрования in ovo или in vitro, нельзя считать, что выделение (вируса путем заражения мышей имеет какие-либо преимущества.. Однако после адаптации, требующей шести или более пассажей легочного экстракта, вирусы гриппа типа А начинают вызывать ярко выраженные патологические изменения в легких, а также гибель животных уже через 48 ч после интра-назального заражения. Вирусы гриппа типа В труднее адаптировать к легким мыши. Эти выраженные патологические изменения, вызываемые вирусом трилпа А, .являются генетическим признаком, но которому идет отбор, причем этот признак независим от способности вируса размножаться в легких. Высокие титры вируса могут быть получены в легких при  заражении неадаптированным  штаммом,  но  размноже-

ние при этом не 'ведет к развитию патологических изменений и гибели (Hirst, 1947a).

Несколько иная картина наблюдается яри адаптации к мышам вируса, выращенного в курином эмбрионе. Первое интраназалыгое заражение обычно вызывает развитие (поражений в леших и гибель животного, в то время как несколько последующих пассажей не вызывают патологических изменений. Это явление можно объяснить токсичностью массивной дозы вируса, который (присутствует в аллантоисной жидкости в высокой концентрации. В организме мышей накапливается при этом очень мало вируса (Sugg, 1950). Специфические поражения легких и гибель мышей отмечаются лишь после 4—10 дополнительных пассажей легочной ткани.

Поражения легких, вызываемые вирусами гриппа у мышей, представляют собой настоящую вирусную пневмонию, похожую во (Многих отношениях на вирусную пневмонию у человека (Loosli, 1949; Mulder, Hers, 1972). Данные, полученные ранее с помощью световой микроскопии и указывавшие на специфическое поражение клеточного покрова альвеол, были подтверждены методом флюоресцирующих антител (Albrecht et al., 1963) и электронной микроскопией (Plum-raer, Stone, 1964). Хотя юсе клетки респираторного тракта чувствительны к 'вирусу, имеются данные о том, что у человека (см. гл. 13) клетки алывеол являются местом первоначального размножения вируса (Albrecht et al., 1963). Этот необычный восходящий путь респираторной инфекции, возможно, является скорее кажущимся, чем реальным. Когда животному под наркозом интраназально вводят вирус, он распределяется по всему респираторному тракту. Размножение вируса может -быть более быстрым в легких, чем в реснитчатом эпителии верхних дыхателыных путей.

При сублетальной инфекции вирус начинает исчезать из легких через 7 дней, что совпадает с появлением гуморальных антител. В процессе выздоровления эпителий альвеол замещается цилиндрическими и кубическими клетками .реснитчатого эпителия бронхиол. Наблюдается также метаплазия с появлением плоского эпителия (Baskerville et a]., 1974).

Поскольку воздушно-капельная передача инфекции от зараженных животных к незараженным происходит >в течение нескольких дней контакта, мыши .представляют собой прекрасную модель для изучения передачи вируса (Schulman, 1969). Мыши широко применялись также для изучения вакцин (Eddy, 1947; Kage et al., 1969), механизмов иммунитета (Schulman et al., 1968) и противовирусных препаратов (Da-vies et al., 1966; Suganuma, Ishida, 1973).

Вирусы гриппа типа А легко размножаются в легких хомяков при минимальных признаках заболевания (Friedewald, Hook, 1948). Те немногие штаммы вируса гриппа В, которые изучались в этом отношении, обладали лишь незначительной патогенностью, «о после адаптации могли вызывать поражения легких (Friedewald, Hook, 1948; Davenport, 1951; Kilbour-ne et al., 1951). В связи с низкой патогенностью вирусов гриппа для хомяков эти животные редко использовались для экспериментальных работ по гриппу. Однако недавно было обнаружено, что хомяки особенно удобны для оценки темпера-турочувствительных штаммов как пригодных для использования в качестве вакцины '(Mills, 'Chanock, 1971). Хомяк — одно из немногих лабораторных животных, имеющих температуру тела 37°С. Как и у хорьков, у хомяков не вырабатываются антитела при введении водной вакцины, если только не было предварительного заражения вирусом гриппа типа А (Potter et al., 1973).

Некоторые другие грызуны также использовались. Stuart-Harris (1937) сообщил, что вирус (гриппа может размножаться в ткани носовых раковин крыс и морских свинок, но не вызывает деструкции эпителия.

В. ПРИМАТЫ (ПОМИМО ЧЕЛОВЕКА)

Использование обезьян в качестве экспериментальной модели для изучения гриппа шло с переменным успехом. Еще в 1937 г. Mclntosh и Selbie пытались вызвать заболевание у макак резусов и зеленых мартышек вирусом H0N1, но безуспешно. Заражение макак резусов и циномольгус вирусом A/FM/1/47 .(.H1N1) дало такой же результат. Клинических проявлений болезни не наблюдалось, но были отмечены характерный некроз и десквамация эпителия (Verlinde, Makste-nieks, 1954).

Saslaw и Carlisle (1965) сообщили, что при заражении аэрозолем удается получить более четкие результаты; этот путь заражения они рассматривали как более естественный, чем интраназальный или интратрахеальный. Они смогли заразить обезьян макак (резусов и циномольгус вирусом типа A/PR8/34 (H0N1). Попытки заразить обезьян штаммами вируса H2N2 и вируса гриппа В были безуспешными. Berendt (1974) тоже использовал аэрозоли с малым размером частиц и сообщил, что у 6 макак резусов, зараженных вирусом типа А/Гонконг/68 (H3N2), наблюдалось выделение вируса во внешнюю среду и (появление антител. Явных клинических проявлений болезни не было. Все животные были иммунны к повторному заражению.

Кенийские павианы (Papio sp.) оказались чувствительными к заражению штаммом H3N2, подобным А/Гонконг/68 (Kalter et al., 1969). Вирус был обнаружен в смывах из глотки; кроме того, у зараженных животных и у животных, со-

державшихся в соседних клетках, появились антитела к вирусу. Клинически выраженного заболевания не было.

Среди приматов гиббоны, ©идимо, потенциально являются одной из наиболее удачных .моделей гриппа (Johnsen et al., 1971). Небольшая группа животных, зараженных штаммом А/То'Нконг/68, не проявила явных 'признаков болезни, но через 2—3 нед респираторные заболевания распространились по всей колонии гиббонов. Отмечались ринит, кашель, депрессия, похудание, желудочно-кишечные расстройства. Болезнь продолжалась в среднем 3—6 дней и выздоровление иногда затягивалось. Четыре гиббона погибли. Спектр клинических проявлений был весьма близок к наблюдаемому у людей. Вторая группа животных, получившая вирус А/Япо-ния/305/57 (H2N2), не заразилась.

В большинстве случаев для заражения обезьян использовались лабораторные штаммы, прошедшие много пассажей в куриных эмбрионах, мышах, хорьках или последовательно на разных объектах. Обезьяны, возможно, были столь же чувствительны к этим штаммам (вероятно, аттенуираванным), как человек. Можно ли успешнее заразить обезьян при использовании вируса, непосредственно полученного у людей, неизвестно. Серологические исследования, проведенные на зеленых мартышках и макаках резусах вскоре лосле их поимки, показали высокий процент антител к H3N2, начиная с 1968 г. (O'Brien, Tauraso, 1973). Сообщение Murphy и со-авт. (1972) тоже было интересным: они описали вспышку, вызванную вирусом, подобным А/Гонконг/68 у обезьян мар-мозет из Колумбии, которая началась до прибытия партии обезьян в лабораторию. Эти данные показывают, что вирус гриппа А человека .может вызывать вспышки у обезьян в определенных условиях, но высокая частота передачи инфекции, возможно, свойственна только вирусу Гонконг.

Г. ТЕЧЕНИЕ БОЛЕЗНИ В УСЛОВИЯХ ПОДАВЛЕНИЯ ИММУНИТЕТА

Воздействия на системы иммунитета у зараженных гриппом животных могут представлять интерес в аспекте повышения чувствительности к инфекции у экспериментальных животных и приобретения чувствительности у невосприимчивых хозяев. Однако сообщений о таких исследованиях немного и опубликованные данные противоречивы. Сообщалось (Singer et al., 1972), что у мышей, подвергнутых действию циклофосфамида, уменьшалась тяжесть заболевания, вызванного вирусом A/PR8. Наоборот, Virelizier и соавт. (1974) нашли, что мыши, получившие циклофосфамид, намного чувствительнее к летальному действию A/PR8, чем, нормальные линии: титр препарата вируса в LD50 был по крайней мере

в 100 раз выше у .мышей, обработанных циклофосфамидом'. Mayer и соавт. (1973) тоже обнаружили, что иммуносунпрес-сия, вызванная циклофосфамидом, усиливает нейровирулент-ность вируса A/NWS. Результаты этих двух работ позволяют полагать, что гуморальные антитела являются важным фактором в выздоровлении мышей при гриппозной инфекции. Мыши с удлиненной вилочковой железой были несколько чувствительнее к вирусу PR8, чем нормальные мыши (Virelizier et al., 1974). Исследование на курах с удаленной фабри-циевой сумкой показали (Portnoy et al., 1973), что у них повышалась чувствительность к заражению ВЧП; это рассматривалось как указание на роль гуморальных антител в выздоровлении от этой инфекции.

IV. ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСА

Пробы для выделения вируса следует брать не позднее чем через 3 дня после начала заболевания. Вероятность выделения вируса быстро снижается после этого срока, но в некоторых случаях вирус можно выделить на 7-й и даже 10-й день болезни. Лучше всего вирус выделяется из носовых смывов. Однако мазки, взятые из глотки и носа, 'более удобны для врача и менее неприятны для больного. Пробы, предназначенные для выделения вируса, следует постоянно держать на холоде и как можно скорее использовать. Если нельзя инокулировать их в течение 48 ч после взятия, следует поместить пробы в закрытый сосуд и .хранить в сухом льду или в рефрижераторе при —70 °С. В летальных случаях при подозрении на гриппозную пневмонию следует пытаться выделить вирус из ткани легких, слизистой трахеи, а также крови. В этих случаях выделение вируса осуществлялось с переменным успехом (iDowdle, Coleman, 1974).

Вирусы гриппа А и В размножаются в куриных эмбрионах и у ряда лабораторных животных. Куриные эмбрионы и культуры клеток точек макак резусов и зеленой мартышки считаются наиболее чувствительными для выделения вируса. Вирус гриппа типа С выделяли только на куриных эмбрионах.

Для максимально успешного выделения вирусов следует заражать 10—11-дневные эмбрионы одновременно в полости амниона и аллантоиса. Эмбрионы инкубируют при 33 °С 3— 4 дня и пробы амниотической и аллантоисной жидкости проверяют на наличие вируса, добавляя эритроциты кур или морских свинок. Эритроциты морской свинки (или группы крови 0 человека) считаются более чувствительными, чем куриные, для обнаружения вирусов H0N1 и H1N1 на ранних пассажах в курином эмбрионе. Это не относится к вирусам,

распространенным в -настоящее время: они -одинаково агглютинируют и те и другие эритроциты. Куриные эритроциты имеют некоторые преимущества: быстрее оседают, чем эритроциты (млекопитающих, титры гемагглютинации их легче учитываются и они менее 'подвержены неспецифической агглютинации сыворотками млекопитающих. В некоторых случаях необходимы два или три «слепых» амниотических иас-сажа, прежде чем вирус достигает титра, достаточного для гемагглютинации. Если вирус размножается или легко адаптируется к размножению при инокуляции в иолость аллан-тоиса, амниотичеекие пассажи не требуются.

Для выделения вируса гриппа типа С 7-дневные куриные эмбрионы заражают в полость амниона и инкубируют при 33°С 5 дней. В полости аллантоиса вирус плохо накапливается  даже после  (многочисленных  пассажей  на   эмбрионах.

Клетки почек зеленых мартышек или макак резусов в мо-нослой'ной культуре в пробирках являются наиболее чувствительной культуральной системой для выделения вирусов гриппа А и В. Неопецифическое (подавление вирусов веществами, содержащимися в сыворотках в культуральной среде, является серьезной проблемой; монослой следует несколько раз промыть средой без сыворотки и использовать такую среду для поддержки культуры после заражения. Вирусы гриппа А хуже растут в культурах клеток, чем вирусы гриппа В. Цитопатический эффект проявляется в виде накопления вакуолизирующихся клеток, которые затем дегенерируют или отделяются от стекла. Цитопатический эффект проявляется в виде накопления вакуолизирующихся клеток, которые затем дегенерируют или отделяются от стекла. Цитопатический эффект слабовыражен, непатогнамоничен, может не выявляться при первых пасса'жах. Присутствие вируса обычно устанавливается гемадсорбцией эритроцитов морской свинки (Vogel, Shelokov, 1957) в течение 3—4 дней после заражения, задолго до развития выраженного цитопатического эффекта.

Большинство выделяемых штаммов вируса гриппа типа В может быть обнаружено гемадсорбцией или тем агглютинацией в течение 3—4 дней после заражения. Цитопатический эффект обычно тоже заметен. Клетки становятся зернистыми, набухают, округляются; позднее развиваются пикноз и фрагментация, слой клеток в конце концов разрушается. Развитие цитолатичесшго действия, и накопление (гемагглютининов могут быть ускорены для вирусов А и В, если поместить пробирки во вращающийся барабан, хотя вероятность выделения вируса от этого не увеличивается.

Следует одновременно культивировать незараженные культуры клеток в пробирках, чтобы исключить возможность случайной контаминации вирусами. Вирус парагриппа типа 2 (SV5), вызывающий гемадсорбцию, является нередким кон-

таминантом в культурах почек макак резусов. Неспецифическая адсорбция старых эритроцитов характерна для большинства культур почечных клеток и может быть ошибочно принята за указание на присутствие вируса (Dowdle, Robinson, 1966), поэтому для гемадсорбции должны использоваться только свежие эритроциты. Большинство культур клеток почки макак резусов содержит вирусы типов SV40 и SV13 («пенящий» вирус). Хотя присутствие этих агентов нежелательно и может помешать интерпретации цитопатического эффекта, они не влияют, 'видимо, на чувствительность клеток •к вирусам гриппа при их выделении.

Трудно оценить количественно эффективность выделения вирусов гриппа А и В в культуре ткани и на эмбрионах. Обилие выделяемых штаммов обоих вирусов сильно варьирует по годам. Вообще говоря, культура клеток почек обезьян имеет преимущество при выделении вирусов В, но степень этого (преимущества варьирует. Вирус А еще более вариабелен и для него куриные эмбрионы чувствительнее клеточных культур. |По этой причине, а также в связи со значительной биологической (как и антигенной) изменчивостью вирусов  гриппа не всегда можно сказать заранее, какой метод выделения окажется более эффективным. Заражение первичных  культур почек макак резусов или зеленых мартышек одновременно с заражением куриных эмбрионов в полость аллан-. тоиса и амниона рекомендуется для выделения максимального количества штаммов вирусов гриппа А и 'В.

ЛИТЕРАТУРА

 Albrecht P., Blaskovic D., Styk В., Roller M. Acta virol. (Prague), 1963

Andrewes С. Н., Laidlaw P. P., Smith W. Lancet, 1934, v. 2, p. 859. Barber W. H., Small P. A. Infect. Immunity, 1974, v. 9, p. 530.  Basarab O., Smith H. Brit. J. exp. Path., 1969, v. 50, p. 612.  Basarab 0., Smith H. Brit. J. exp. Path., 1970, v. 51, p. 1. Baskerville A., Thomas G., Wood M., Harris W. J. Brit. J. exp. Path., 1974,v. 55, p. 130.

Beare A. S., Keast K. A. J. gen. Virol., 1974, v. 22, p. 347

Becht И. J. gen. Virol, 1969, v. 4, p. 215.

Berendt R. F. Infec. Immunity, 1974,

Bernkoff H. Proc. Soc. exp. Biol., 1949, v. 72, p. 680.  Boveridge W. I. В., Burnet F. M. Med. res. Counc. (Gt. Brit.). Spec. Rep. Ser.,

J946, v. 256. Blaskovic P., Rhodes A. J., Labzoffsky N. A. Arch. ges. Virusforsch., 1972

Blaskovic P., Rhodes A. J., Labzoffsky N. A. Arch. ges. Virusforsch., 1972b,

Bd 39, S. 299.

Burnet F. M. Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1940, v. 18, p. 353. Burnet F. M., Bull D. «.Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1943, v. 21, p. 55. Came P. E., Pascale A., Shimonaski G. Arch. ges. Virusforsch., 1968, Bd 23