США. Регуляция внутриклеточных пулов кальция: мембранные основы сердечных аритмий

  

Вся библиотека >>>

Оглавление книги >>>

 


ВНЕЗАПНАЯ СМЕРТЬ Материалы 2-го советско-американского симпозиума 1979 Индианаполис США


Под ред. А. М. Вихерта (СССР) и Б. Лауна (США)

 

Регуляция внутриклеточных пулов кальция: мембранные основы сердечных аритмий

 

Г. Р. Бэш, Л. Р. Джоунс, Дж. П. Линдеманн, О. М. Ватанабе

(США)

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Основой электрической активности миокарда является асимметричное распределение ионов относительно мембран, поэтому изменение взаимодействия миокардиальных мембран с ионами может в конечном итоге сыграть определенную роль в развитии внезапной смерти. В миокарде существуют две хорошо развитые мембранные системы, ответственные за поддержание высоких ионных градиентов. Это внешняя плазматическая мембрана — сарколемма и внутренняя система тубулярных мембран — саркоплазматический ретикулум. Хорошо установлено, что ионы кальция влияют на электрическую активность    миокарда и что и СЛ и СР принимают   участие в регуляции внутриклеточной концентрации ионов кальция в миокарде. Более того, показано, что катехоламины обладают действием как на СЛ, так и на СР [1], а также что ацетилхо-лин может изменять восприимчивость клеток миокарда к сигналам симпатических медиаторов [2].

Основная цель наших исследований состояла в изучении молекулярных основ действия катехоламинов и ацетилхолина на функции сердечных мембран. Основное внимание в этих исследованиях было уделено взаимодействию кальция с этими двумя мембранными системами. Нами были поставлены следующие задачи: 1) выделить и очистить СЛ и СР —две основные кальций-регулирующие мембраны; 2) идентифицировать и описать на молекулярном уровне свойства канала, ответственного за генерацию медленного входящего кальциевого тока; 3) установить на уровне миокардиальных мембран молекулярные основы функционального взаимодействия адренершческих и холинергических стимулов. В настоящем сообщении сделана также попытка дать краткий обзор экспериментальных достижений, способствующих решению первых двух из перечисленных задач.

 

МЕТОДЫ

Исследования фракций изолированных мембран проводили на неочищенных микросомальных фракциях миокарда собаки [3], а также на очищенных препаратах СЛ и СР в форме везикул [4]. Фосфорилирование мембранных белков в интактном сердце осуществляли с помощью метода, аналогичного недавно описанному Корр и Barany

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Хотя сердечные микросомы содержат смесь мембранных везикул, образованных из нескольких клеточных мембран, анализ маркёров показывает, что суммарное содержание вези» кул СЛ и СР составляет около 80—90% от общего количества везикул в смеси. Препарат грубых везикул был разделен на фракции в градиенте плотности сахарозы; относительное содержание энзиматических и неэнзиматических маркёров во фракциях СЛ и СР указывает на высокую степень очистки микросомальных везикул (рис. 1). Таким образом, было показано, что бета-адренергические рецепторные места, адренерги-ческие рецепторные места, аденилатциклаза и сиаловые кислоты мигрируют в градиенте плотности сахарозы вместе с маркерным ферментом сарколеммы—(Na+, К+)-АТФазой. С другой стороны, маркерный фермент СР (Са2+, К+)-АТФаза отчетливо отделяется от сарколемных маркёров.

В соответствии с многообразием функций СЛ и СР состав белков в этих очищенных мембранах оказался состоящим по крайней мере из 30 отдельных компонентов в каждой фракции. Электрофореграммы субфракций сердечных микросом СЛ и СР и исходной грубой фракции мембранных везикул в по-лиакриламидном геле представлены на рис. 2. Сравнение профилей окрашивания при использовании трех разных красителей (Кумасси синий, реактив Шиффа, «Стейнз-ол») показывает, что по крайней мере 5 основных белков, присутствующих в сарколемной фракции, принадлежат исключительно этой мембране. Точно так же по крайней мере 8 различных белков присущи только СР.

Существует множество подтверждений тому, что основные эффекты катехоламинов инициируются реакцией фосфорили-рования, стимулируемой циклическим аденозин-3',5'-моно-фосфатом (щАМФ) [1]. Для локализации мембранных белковых субстратов цАМФ-зависимой протеинкиназы мы использовали выделенные in vitro препараты сердечных СЛ и СР [6]. Очищенные СЛ и СР инкубировали с [7~32Р]-АТФ (адено-зинтрифосфат) как в отсутствие цаМФ, так и при его добавлении в среду. Для препаратов СЛ циклический АМФ стимулировал включение [32Р] по крайней мере в 6 белковых полос, молекулярная масса которых находится в диапазоне от 200 000 до 8000 (рис. 3). Скорее всего эти белки являются субстратами эндогенной цАМФ-зависимой протеинкиназной активности СЛ. Регуляторная единица протеинкиназы представлена темной линией с молекулярной массой приблизительно 55 000 (неопубликованные результаты). Можно предположить, что субстрат протеивкиназы с молекулярной массой около 10 000 или 8000 участвует в регуляции медленного входящего кальциевого тока [1, 6]. Как показано на правой панели рис. 3, белки GP также фосфорилируются в присутствии [у—32Р]-АТФ. Однако это включение [32Р] не стимулируется цАМФ. Как бы то ни было, цАМФ немного уменьшает общее включение радиоактивного фосфата, как это показано заштрихованными столбиками. Следовательно, можно сделать вывод, что СР не содержит эндогенной цАМФ-зависимой протеинкиназы. Однако в других работах [1] и нами [6] было показано, что СР содержит белковые субстраты для растворимой цитоплазмати-ческой пАМФ-зависимой протеинкиназы. Одним из них является фосфоламбан [6].

Уместно спросить, имеют ли эксперименты, проведенные на изолированных мембранах, какое-либо отношение к тому, что действительно происходит in vivo. Для решения этой задачи мы метили эндогенные пулы фосфита изолированных - перфузируемых сердец морских свинок с помощью радиоактивного неорганического фосфора ([32Р]). Было показано, что после установления равновесия метаболически активные сердечные клетки превратили фракцию [32Р] в [у—32Р]-АТФ [7]. Затем добавляли к перфузионному раствору изопротеренол (в концентрации 10~~7 М) и исследовали изменения сократимости, внутриклеточного уровня цАМФ и включения 32Р в сердечные микросомы. На рис. 4 показано увеличение сократимости (dl/dt) и соответствующее увеличение внутриклеточного уровня цАМФ. Ясно видно, что обе величины выросли, как и ожидалось при перфузии сердец изо-протеренолом.

После двух минут перфузии сердца быстро замораживали-в зажимах, и из этих сердец были приготовлены препараты мембранных везикул. Затем проводили гель-электрофорез и авторадиографию солюбилизированных мембран для оценки степени фосфорилирования мембранных белков в интактном функционирующем сердце. После адренергичеокой стимуляции изопротеренолом обнаружено увеличение удельного фосфорилирования по :кражней мер двух мембранных белков (рис. 5). Эти белки мигрируют с молекулярной массой около 20 000 и около 10 000 и могут соответствовать белкам аналогичной подвижности, которые фосфорилируются in vitro в очищенных мембранных препаратах.

Таким образом, можно предположить, что фосфорилиро-вание мембранных белков является конечным путем, по которому медиаторы вегетативной нервной системы изменяют электрические свойства сердца. Так как это фосфорилирование приводит к изменению метаболизма Са2+ под действием мем-браносвязанных белков, оно может вносить свой вклад в электрическую неустойчивость сарколеммы.

Это исследование было проведено отделением фармакологии и токсикологии, отделением медицины и Краннертовским институтом кардиологии Медицинской школы Университета штата Индиана, Индианаполис, штат Индиана. Оно было также поддержано субсидиями S01-RR-95371, HL-23704, HL-06308, HL-18795 и HL-07182 Национальных институтов здоровья, субсидиями Американской кардиологической ассоциации    (Индианский   филиал), Фондом Германа С. Краннерта.

 

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

 

1.             Wollenberger A., Will H. Protein kinase-catalyzed membrane phospho-

rylation and its possible relationship to the role of calcium in the adre-nergic regulation of cardiac contraction.— Life. Sci., 1978, 22: 1159— 1178.

2.             Watanabe  A.   M.,     McConnaughey   M.     M.,    Strawbridge  R.  A.,    Fle-

ming J. W., Jones L. R., Bech H. R. Jr. Muscarinic cholinergic receptor modulation of beta-adrenergic receptor affinity for catecholami-nes.— J. Biol. Chem., 1978, 253 : 4833—4836.

3.             Besch H. R. J., Jones L. R.,  Watanabe A. M. Intact vesicles of canine

cardiac sarcolemma: Evidence from vectorial properties of Na+, K+-ATPase.— Circ. Res., 1976, 1976, 39 : 586—595.

4.             Jones L. R., Besch Ii. R. J., Fleming J. W., McConnaughey M. M., Wa-

tanabe A. M. Separation of vesicles of cardiac sarkolemma from vesicles of cardiac sarcoplasmic reticulum. Comparative biochemical analysis of component activities.— J. Biol. Chem., 1979, 254 : 530—539.

5.             Kopp S. J., Barany M. Phosphorylation of the 19 000-dalton light chain

of myosin in perfused ra heart under the influence of negative and positive inotropic agents.— J. Biol. Chem., 1979, 254: 12007—12012.

6.             Tada M-, Kircjberger M. A., Katz A. M. Phosphorylation of a 22 000-dal-

ton component of the cardiac sarcoplasmic reticulum by adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase.—J. Biol. Chem., 1975, 250: 2640-2647.

 

Следующая глава >>>