Свёртывание крови

В последние годы при коагулологических исследованиях стали применять амидолитические методы, основанные на использовании хромогенных субстратов. Такие субстраты представляют собой синтетические олигопептиды, как правило, три- или тетра-оептиды, имитирующие фрагмент естественного субстрата, предшествующий месту его протеолитического расщепления, к которому амидной связью присоединен хромофор-п-нитроанилин (pNA). В связанной с белком форме pNA бесцветен, при расщеплении яод действием фермента он высвобождается, давая желтое окрашивание, которое можно наблюдать при помощи спектрофотометра (максимум световой абсорбции при 405 нм). В оптимальных тест-системах степень увеличения световой абсорбции прямо пропорциональна активности фермента,    действующего на субстрат.

Начало этому новому направлению лабораторной коагулологии положено в 50-х годах исследованиями Nourath и Schwert, впервые отметивших, что эфиры аминокислот являются чувствительным субстратом для протеолитических ферментов. В 1954 г. S. Sherry и W. Troll доказали способность тромбина, плазмина и других ферментов свертывающей и фибринолитической систем крови (факторов X, XI, XII, урокиназы, тканевых активаторов ялазминогена)  гидролизовать эфиры аминокислот и предложили использовать основанные на этом принципе эстеролитические методы для коагулологических исследований. Новым этапом в разработке синтетических субстратов явилось предложение Erlanger заменить эфирную группу на нитроанилин, что привело к замене эстеролитических методов на более чувствительные ами-долитические. Применение этих методов в коагулологии стало возможным благодаря успехам химии белка и выяснению молекулярной структуры и аминокислотной последовательности большинства коагуляционных белков и их ингибиторов.

В настоящее время установлено, что процесс активации ферментов свертывающего каскада сопровождается отщеплением сравнительно небольшого фрагмента молекулы. Изучена аминокислотная последовательность в той части молекулы естественного субстрата, где происходит расщепление. В. Blomback и соавт* (1969—1972) описали молекулярную структуру фибриногена и продуктов его деградации, а также аминокислотную последовательность в месте расщепления молекулы фибринопептида А тромбином. Установлено, что фермент-субстратная специфичность определяется не столько размером молекулы субстрата, сколько стерической конфигурацией фрагмента, предшествующего меету его протеолитического расщепления, и состоящего, как правило, из 3—4 аминокислотных остатков. Была предпринята попытка синтезировать малые аминокислотные фрагменты, которые бы моделировали соответствующую реакцию расщепления естественного субстрата, с целью получения антикоагулянтов для клинического-применения. Хотя эти попытки не увенчались успехом из-за короткого срока жизни в кровотоке полученных препаратов, идея использования таких короткоцедочечных пептидов для определения свертывающих ферментов оказалась вполне реальной, поскольку синтетические олигопептиды, имитирующие аминокислотную последовательность активного фрагмента естественного субстрата, обладали высокой чувствительностью и достаточной специфичностью по отношению к коагуляционным ферментам.

В 1972 г. появилось первое сообщение о фотометрическом определении факторов свертывания крови с использованием синтетических субстратов (L. Svendsen и соавт.). Создание аппаратов для крупномасштабного синтеза белка открыло возможности для промышленного производства хромогенных субстратов и их применения в коагулологических исследованиях. С этого времени начинается новая эра в лабораторной коагулологии, которая, по словам Н. Stormorken, знаменует переход от секундомера к спектрофотометру, от ручных методов исследования к автоматическим.

В последние годы созданы некоторые синтетические пептидные субстраты, воспроизводящие аминокислотную последовательность вблизи места ферментативного расщепления. Принцип искусственного моделирования аминокислотной последовательности естественных коагуляционных белков можно продемонстрировать на примере создания хромогенных субстратов для тромбина S-21BO, S-2238 и Chromozym-TH на основе известной молекулярной структуры N-терминальной части Аа-цепи фибриногена.

Главным местом расщепления фибриногена тромбином является связь Arg-Gly между позициями 16 и 17. В хромогенном субстрате S-2160 (BZ-Phe-Val-Arg-pNA) последовательность Val-Arg имитирует последние два остатка фибринопептида А, непосредственно предшествующие месту расщепления тромбином  (остатки 15 и 16 N-конца), а фенилаланиновый остаток (в позиции 8 ■фибринопептида А) включен, поскольку он имеет важное значение во взаимодействии тромбина с фибриногеном  [Blomback M., 1977; Scheraga, 1977].    В хромогенном субстрате Chrobozym-TH (Z-Gly-Pro-Arg-pNA)    последовательность Gly-Pro-Arg соответствует трем аминокислотным остаткам 17—19, ближайшим к связи Arg-Gly нативного фибринопептида А, который расщепляется с -большой скоростью тромбином, и двум    остаткам  19—20 связи Arg-Val, расщепляемой с небольшой скоростью тромбином в а-це-пи фибринопептида А и дисульфидиом узле фибриногена [Blomback В., 1972]. Субстрат S-2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA) является гибридом S-2160 и Chromozym-TH; Pip-кислотный остаток — близкий аналог пролина, поэтому последовательность Pip-Arg S-2238 напоминает последовательность Pro-Arg Chromozym-TH, а фени-лаланиновая часть — структуру S-2160. Пока неясно, почему яти субстраты, чувствительные к тромбину, нечувствительны к реп-тилазному расщеплению, хотя известно, что рептилаза расщепляет пептидные связи как 16—17, так и 19—20 а-цепи   фибринопептида А, чувствительные к тромбину [Blomback В., Blomback M., 1972].

На основе моделирования активной части молекулы естественного плазмина (С-концевой части тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность Pro-Gly-Arg) был синтезирован модельный субстрат Bz-Pro-Gly-Arg-pNA. Оказалось, однако, что специфичность субстрата неодинакова для урокиназы и других эндогенных активаторов плазминогена (тканевых и плазменных), Тогда путем замещения части Bz-Pro были получены два более чувствительных и специфичных субстрата: Pyro-Glii-Gly-Arg-pNA (S-2444) для определения урокиназы и H-D-Val-Gly-Arh-pNA (S-2322) для определения тканевых и плазменных активаторов плазминогена [Claeson G. et al., 1978] и еще более специфичный его аналог N2-Bz-L-Val-Gly-L-Arg-pNA — Chromozym-UK (Pento-pharm).

Еще один пример — создание хромогенного субстрата, чувствительного к фактору Ха. Установлено, что обоим местам расщепления бычьего протромбина фактором X предшествует идентичная аминокислотная последовательность Ile-Glu-Gly-Arg [Aurell et al., 1978]. Молекула протромбина человека имеет ту же последовательность, только остаток Gin в С-концевой части а-цепи заменен на остаток Asp. Синтезированный    на этой основе хромогенный субстрат Bz-Ile-Glu-Gly-Arh-pNA (S-2222) оказался чувствительным как для человеческого, так и для бычьего фактора Ха. Чувствительность субстрата удалось повысить еще на 20% путем замены Glu на Gin. В дальнейшем путем модификации •у-карбоксилъной группы глутаминового остатка были созданы еще более чувствительные дериваты морфолиниламид и пиперидила-мид, давшие субстрат, в 2'/г раза быстрее реагирующий с фактором Ха [Aurell L. et al., 1977].

Созданы хромогенные субстраты, чувствительные к компонентам кишш-калликреиновой системы. Имитацией G-концевой последовательности (Pro-Phe-Arg) брадикинина, высвобождаемого из кининогена под действием калликреина, создан чувствительный субстрат для определения калликреина плазмы: H-D-Pro-Phe-Arg-pNA  (S-2302)   [Claeson G. et al., 1978].

На том же принципе моделирования активной части молекулы естественного субстрата основан синтез всех других    выпускаемых в настоящее    время олигопептидов.    На основе имеющихся хромогенных субстратов уже разработаны    методы определения большинства факторов свертывающей системы   крови   (протромбин, тромбин, антитромбин III, гепарин, факторы X и Ха, факторы 3 и 4 тромбоцитов), фибринолиза   (плазминоген, плазмин, анишлазмин, урокиназа), кинин-калликреиновой   системы   (кал-ликреин плазмы, тканей, мочи, прекалликреин плазмы). Раара-батываются также субстраты и методы для определения    факторов VIII и IX, тканевого активатора плазминогена, стрептокина-зы. Все эти методы основаны на общем принципе — расщеплении синтетического субстрата соответствующим ферментом с последующей спектрофотометрическрй оценкой разницы в оптиче-  , ской  плотности  исходного    субстрата  и высвобождаемого  pNA. В реакции могут использоваться    ферменты    различной степени очистки или их активаторы. В оптимальных тест-системах степень увеличения световой абсорбции, зависящая от количества высвобождаемого pNA, прямо пропорциональна, активности действующего на субстрат    фермента. В соответствии    с международным стандартом, специфическая активность субстратов по отношению к различным серин-протеазам выражается в каталах (кат). Таким образом, в отличие от обычных коагулологических тестов, основанных на регистрации времени (секундомером) образования или растворения фибрина и являющихся по существу косвенными методами оценки активности фермента, амидолитическпе методы позволяют непосредственно определять  (спектрофотомет-рически)  степень активации ферментов свертывающего    каскада in vivo. Это важно, например, в диагностике    ДВС, при котором выявление повышенной активности тромбина in vivo может служить доказательством внутрисосудистого тромбообразования. Высокая чувствительность амидолитических методов дает возможность регистрировать спонтанную ферментную активность, возникающую при некоторых патологических состояниях. Более того, путем применения специфических активаторов, ингибиторов и ферментов можно определить содержание проферментов, биологических активаторов и ингибиторов. Это значительно расширяет возможности изучения факторов свертывания крови и фибринолиза.

Важным преимуществом амидолитических методов перед обычными коагулологическими являются: легкость их стандартизации благодаря точно установленной структуре синтетического субстрата, большая точность спектрофотометрического определения; при амидолитическом определении исключается конформация фибрина как конечная стадия реакции свертывания и поэтому условия, влияющие на фибринообразование, не мешают проведению иссле-дования [Bergstrom К., Blomback M., 1974]; высокая чувствительность синтетических пептидов позволяет использовать большие разведения плазмы, благодаря чему снижается эффект ингибиторов. Для осуществления этих методов потребуется небольшой объем требуемой для исследования плазмы (5—20 мкл), что очень важно при проведении серийных определений в клинике, а также при работе с мелкими экспериментальными животными. Экономия субстрат-дефицитной плазмы особенно важна при изучении таких сравнительно редких заболеваний, как дефицит фактора Хагемана или фактора Флетчера. Амидолитические реакции быстро и хорошо воспроизводятся: они легко адаптируются к имеющимся ферментным анализаторам. Все это делает амидолитические методы ценными для характеристики очищенных ферментных препаратов, при стандартизации препаратов крови, для выявления природы тромбогенных примесей, возникающих на разных стадиях производства гемостатических и фибринолитиче-ских препаратов, а также при проведении динамических коагулологических исследований.

Следует отметить, что хромогенные субстраты не лишены недостатков. Основным из них является недостаточно высокая специфичность. Воспроизводя лишь небольшую часть целой молекулы, они не дают информации о стерической структуре, что до некоторой степени снижает их специфичность [Mattler L., Bang N., 1977]. Плазмин, например, способен расщеплять субстраты, предназначенные для тромбина и фактора Ха. Поэтому при использовании всех синтетических нитроанилидов следует учитывать возможность генерации плазмина и присутствия его примесей в реактивах [Suomela H., 1978]. Неабсолютная специфичность хромогенных субстратов требует использования оптимальных активаторных систем, очищенных ферментов и высокоспецифичных ингибиторов. Все это ограничивает возможность их широкого применения.

Наряду с повышением качества имеющихся и созданием ноны?, более специфичных синтетических субстратов для определения свертывающих белков проводятся исследования, направленные на оптимизацию методологических возможностей — это разработка оптимальных тест-систем и условий проведения реакций. Предложено, в частности, несколько способов усиления окраски с целью повышения чувствительности амидолитических методов. Так, Н. Kwaan и соавт. (1978) рекомендуют использовать прямое покрытие амина. pNA альдегидом (4-диметиламино-циинамальдегид, ДАЦА), применяемые при хроматографии. ДАЦА образует комплекс с pNA, обладающий более высокой абсорбционной способностью и дающий более интенсивную окраску. Этот метод одноступенчатый. Введение в реакцию НС1 еще более упрощает реакцию, так как исключает этап центрифугирования и дает возможность приспособить метод к автоматизированным системам анализа.

Хотя некоторые амидолитические методы применяются в коагу-лологии уже около 8 лет, большинство из них предложено в последние два года, и опыт их применения пока невелик. Яе останавливаясь на технических деталях методов с использованием хромо генных субстратов, описанных в цитируемой нами литературе, приведем в качестве примера лишь принципы некоторых из них и предварительные результаты их клинического применения.

Тромбин. С созданием чувствительных к тромбину хромогеи-кых субстратов Ghromozym-TH появилась возможность амидоли-тическои оценки тромбина в плазме in vivo — прямое доказательство внутрисосудистого свертывания крови при ДВС. Тромбин, активируемый in vivo, катализирует высвобождение желтого pNA из.бесцветного пептидного субстрата. Количество pNA, высвобождаемого в 1 мин, пропорционально активности тромбина в пробе:

Tos-Gly-Pro-Arg-pNA   TpoMOII-S-  Tos-Gly-Pro-Arg-OH+pNA.

Этот метод применили R. Herrmann и P. Bailey (1979) в 6 случаях отравления ядом австралийской змеи. У всех больных с характерными признаками дефибринации отмечено повышение уровня тромбина в плазме при определении его в реакции с хро-могенным субстратом Chrornozym-TH.

Активность фактора X снижена при болезнях печени (нарушение синтеза) и лечении антагонистами витамина К. Наряду с определением протромбина, амидолитическое определение фактора X является перспективным методом контроля за антикоагулянтной терапией [Witt I. et al., 1977].

Интересна также возможность использования хромогенного субстрата S-2222 для прямого определения степени активности фактора X in vivo. В норме фактор X присутствует в плазме только в неактивой форме. Однако Н. Vinazzer (1979) наблюдал появление в кровотоке фактора Ха — активной формы этого свертывающего фермента при активации свертывающего каскада (ДВС). Полупериод жизни в кровотоке фактора Ха не превышал 2 мин из-за быстрой инактивации его антитромбином III. Автор предложил добавлять в кровь в момент ее взятия кроличьи иммуноглобулины, направленные против антитромбина III человека. Таким образом достигалось увеличение полупериода жизни фактора Ха до 30 мин, что позволило осуществить определение. М. Seghatchian (1978) предложил использовать хромогенный субстрат S-2222 для определения генерирующей фактор Ха активности тромбоцитов. Последняя, по мнению автора, может служить показателем жизнеспособности тромбоцитов после трансфузий, а также их функциональной активности в процессе консервирования. Метод может найти применение в клинике для диагностики тромбоцитопатий различного генеза.

Факторы XII и ХПа. Для определения фактора XII используют субстраты S-2302 и Chromozym-PK [Vinazzer И., 1978]. Метод основан на способности фактора XII активировать превращение прекалликреина плазмы в калликреин. В присутствии избытка прекалликреина количество активного калликреина, образованного из предшественника, прямо пропорционально содержанию активного фактора XII. Для активации фактора XII тестируемую плазму инкубируют с суспензией каолина или коммерческим контактным активатором Cephotest.

На том же принципе, но без предварительной активации каолином основано и определение фактора ХПа в случаях внутрисо-судистой активации фермента (при ДВС и коагулопатии потребления, после массивных гемотрансфузий, в течение 1-го часа после крупных операций, в период отторжения почечных трансплантатов [Vinazzer H., 1978].

Фактор VIII. На основе применения хромогенного субстрата S-2222 разработан двухступенчатый метод определения фактора VIII' [Seghatchian M., Miller-Anderson M., 1978]. На первом этапе реагент, состоящий из фактора 1Ха, тромбоцитов, Са2 + и фактора X, инкубируют в течение 10—15 мин с различными разведениями фактора VIII. За этот период достигается оптимальная генерация фактора Ха. Образованный фактор Ха как серин-про-теаза на втором этапе расщепляет S-2222. Использование синтетического субстрата вместо субстрата — плазмы позволяет избежать необходимости определения конечной точки образования сгустка.

Описаны различные модификации этого метода [Shorkorken H., 1977; Abildgaard С. et al., 1977; 0dergard О., Abilgaard U., 1977; Scully M., Kakkar V. и др., 1977]. С помощью амидолитического метода определения антитромбина III получают результаты, коррелирующие с данными иммунологического определения по Man-dm. О. 0degard и С. Abildgaard (1978), изучая амидолитическим. методом уровень антитромбина III у 322 больных, обнаружили ■снижение содержания этого естественного антикоагулянта до 20% нормы у лиц со злокачественными опухолями, артериальными тромбозами, множественными травмами, септическими заболеваниями, болезнями печени, при ДВС и после приема per os контрацептивов. Снижение уровня антитромбина III связывают с нарушением синтетической функции печени и повышенным потреблением антитромбина III при этих заболеваниях. Н. Stor-» morwen и Erikssen (1977) наблюдали большую группу больных инфарктом миокарда, у которых с помощью хромогенного метода выявлено значительное снижение уровня атитромбина III. Описаны также случаи наследственного дефицита антитромбина III с выраженной тенденцией к тромбообразованию [Sas G. et al., 1974; Marciniak E. et al., 1974]. Исследования in vitro показали, что при низком содержании антитромбина III в плазме для получения атикоагулянтного эффекта требуются гораздо более высо-•кие концентрации гепарина. Опыт лечения тромбозов у больных с дефицитом антитромбина III подтверждает данные, полученные in vitro [Barthels et al., 1978].

Повышение активности антитромбина III обнаружено у боль-икх, лечившихся кортикостероидами, а также при болезни Кушинга.

Bartl и Ziegehorn (1978) предложили новый, более простой одноступенчатый метод определения концентрации гепарина в плазме, используя Chromozym-TH. Радиационную смесь, содержащую-буфер, тромбин и смешанную нормальную плазму, инкубируют с образцом испытуемой плазмы и гепарином. После инкубации добавляют хромоген и спектрофотометрически регистрируют разницу световой абсорбции контрольного и тестируемого образца. Метод адаптирован к автоматическому анализатору. В комбинации с определением антитромбина III его можно использовать-для контроля гепаринотерапии.

Плазминоген, плазмин, антиплазмии. Создание чувствительных к плазмину хромогенных субстратов (S-2251, Chromozym-PL) облегчило изучение компонентов фибринолитической системы. Отмечена высокая чувствительность этих субстратов к низким концентрациям плазмы (менее 10~и моль). Разработанный амидо-литический метод можно легко автоматизировать [Friberger P. etal., 1978].

Teger-Nilsson (1978) у больных различных групп с помощью» этого метода обнаружила снижение уровня аг-антиплазмина на фоне повышенного фибринолиза: при лечении стрептокиназой, у больных циррозами печени. Повышение содержания антиплазми-на наблюдалось в послеоперационном периоде, после родов, вовремя острого тромбоза с клиническими проявлениями заболевания.

Z. Latallo и соавт. (1978) разработали комплекс тестов, основанных    на использовании хромогенного    субстрата S-2251, для определения 5 компонентов фибринолитической системы: спонтанной плазминовой активности, уровня плазминогена, актива-торной активности, содержания антиплазминов и аг-макроглобу-лина. Все эти определения можно выполнить в течение 45 мин с использованием всего 0,4 мл стандартного препарата плазмина. Авторы отмечают и некоторые недостатки амидолитических методов. Во-первых, выявление амидолитической активности не обязательно означает присутствие протеолитической активности. Известно, например, что аг-макроглобулин, протеолитический ферментный комплекс, будучи высоко активным в отношении малых синтетических субстратов, имеет низкую активность по отношению к крупномолекулярным субстратам. Спонтанная активность плазмина в плазме, измеренная в этой системе, фактически отражает активность а2-макроглобулинплазминового комплекса, так как не ингибируется апротииином [Teger-Nillson et al., 1978]. Во-вторых, хромогенные субстраты, как отмечалось выше, не являются моноспецифичными, и определяемая протеолитическая активность может зависеть, кроме плазмина, от присутствия дру-:тих ферментов. Так, субстрат S-2251, наиболее чувствительный к плазмину, легко гидролизуется также трипсином и чувствителен, хотя и в меньшей степени, к тромбину, фактору Ха, каллн> крепну плазмы, урокиназе. Поэтому во всех случаях необходимо проводить контроль с помощью обычных коагуляционных тестов. Из-за недостаточной специфичности имеющихся субстратов пока затруднены и прямая количественная оценка фибринолитических ферментов и' степени их активации in vivo [Fassler H. et al., 1978].

Описан новый метод гистохимического определения тканевой активности фибринолитических ферментов на агаровых пластинках с нанесенными на них хромогенными субстратами: S-2227 и Chro-mozym-UK для определения урокиназы и S-2251 для определения плазмина [Stemberger A. et al., 1978]. Срезы тканей помещают на агаровые пластинки с нанесенным на них хромогенным субстратом и после инкубации в стандартных условиях при 37° С производят. диазотизацию, изменяющую слабую желтую окраску на интенсивное красное окрашивание.

Изучены различные здоровые и патологически измененные органы: почки, поджелудочная железа, кровеносные сосуды. Показана возможность специфической дифференциации активности уро-киназы, плазмина и тканевых активаторов плазмина в этих органах.

Прекалликреин плазмы (фактор Флетчера), калликреин. На основе субстратов S-2302 и Chromozym-PK разработаны методы «определения прекалликреина и калликреина.

Уровень    калликреина     определяют      спектрофотометрическв [Claeson G. et al., 1978].

P. Friberger и соавт. (1977) для активации прекалликреина использовали стандартный коммерческий контактный активатор Cephotest. Метод испытан на образцах плазмы с дефицитом факторов Флетчера, Фитцжеральда и фактора XII для диагностики этих состояний в клинике. Доказана также возможность спектро-фотометрического выявления активированного in vivo (в сосудистом русле) калликреина, что имеет важное значение для диагностики ДВС. При этом активность калликреина в плазме определяется без предварительной активации декстрансульфатом [Kluft, 1978].

Хромогенный метод определения прекалликреина применен для выявления наследственного дефицита фактора Флетчера и его дифференциальной диагностики с дефицитом других контактных факторов — фактора XII и высокомолекулярного кининогена [Soulier J., Gozin, 1979]. Снижение активности прекалликреина обнаружено у больных с тромбозами [Witt I., 1977] и при экспериментальном эндотоксическом шоке у собак [Gallimore et al., 1978]. Эти наблюдения свидетельствуют в пользу активации ки-шш-калликреиновой системы при тромбоэмболических состояниях, сопровождающихся потреблением прекалликреина и высвобождением брадикинина.

Фактор 3 тромбоцитов. Хотя структура, ответственная за активность фактора 3 тромбоцитов, пока не установлена, для определения этого фактора предложено использовать субстрат S-2238 [Sandberg H., Andersson D., 1979]. Метоы основан на генерации тромбина, с его помощью выявляются фосфолипид и другие факторы, высвобождаемые из тромбоцитов после активации их тромбином. Чувствительность и специфичность метода выше, чем обычного Stypren-теста, основанного на активации фактора X иУ ядом змеи Руссела. Полагают, что при выявлении предтромботи-ческих состояний амидолитическая характеристика реакции высвобождения предпочтительнее, чем радиоиммунным определением фактора 4 тромбоцитов или Р-тромбоглобулина.

Опыт клинического применения всех указанных методов пока невелик, их клиническую релевантность предстоит подтвердить на большем числе наблюдений. В настоящее время хромогенные методы используют обычно как дополнение к обычным коагуляци-онным тестам, служащим для диагностики различных наследственных и приобретенных нарушений системы гемостаза [В1о-mback M., 1979; Ререг et al., 1979; Herrmann R., Bailey, 1979]. Предварительные результаты, полученные в разных странах, свидетельствуют о ценности амидолитических методов для раннего выявления ДВС, в контроле антикоагулянтной и фибринолитической терапии [Teien A. et al., 1976; Miller-Anderssen M., Seghat-hian M., 1977; Witt I. et al., 1977; Seghatohian M., 1978; Kirch-'.hof B. et al., 1979]. С помощью хромогенных субстратов можно выявить активированные свертывающие ферменты до появления клинических признаков тромбоза и раньше, чем их удается обнаружить другими лабораторными методами. Возможность определения активных форм свертывающих факторов в кровотоке in vivo (тромбин, факторы Ха и ХПа) имеет важное значение для ранней диагностики тромботических состояний и реакций отторжения. Ценность этих тестов как показателя начинающегося внутрисосу-дистого свертывания изучается в клинике [Vinazzer H., 1978]. Хромогены оказались также ценным средством для стандартизации ферментных препаратов, селекции исходного материала и производства гемостатических и фибринолитических препаратов, а также идентификации тромбогенных примесей на разных этапах их производства [Stormorken H., 1976; Miller-Andersson M., .Seghatchian М., 1976, 1978; Svendsen L., 1978]. До тех пор, одна-жо, пока не будут получены синтетические субстраты, обладающие высокой специфичностью к отдельным серинпротеазам коагу-ляционного каскада, амидолитические методы следует рассматривать скорее как дополнение, чем как альтернативу обычным коагуляционным тестам.

Важной задачей является получение высокоспецифичных субстратов для факторов VII, VIII, IX, IXa, XIa, ХПа и ХШа, эндогенных активаторов плазминогена, системы комплемента. Необходима также разработка стандартных очищенных ферментных препаратов: фактора Ха, тромбина, калликреина, прекалликреина.