 |
|
|
Виноградский. МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ |
АНАЭРОБНОЕ УСВОЕНИЕ АЗОТА
|
С.Н. Виноградский
Смотрите также:
Биографии биологов, почвоведов
|
CLOSTRIDIUM PAST OKIANUM, ЕГО МОРФОЛОГИЯ И ЕГО СВОЙСТВА КАК ВОЗБУДИТЕЛЯ МАСЛЯНОКИСЛОГО БРОЖЕНИЯ
В 1895 г. я открыл в почве анаэробную бациллу, названную мною Clostridium pastorianum, способную развиваться в среде с сахаром без связанного азота, сбраживая сахар и усваивая свободный азот пропорционально сброженному сахару.
За исключением сложного, совершенно неисследованного явления симбиотического усвоения азота и еще сомнительного усвоения его водорослями, это был первый определенный вид бактерий, у которого указанная, представляющая такой интерес функция была установлена путем прямых опытов. В то время я посвятил свою статью целиком вопросу усвоения •азота, только затронув в ней морфологию Clostridium и его активность как возбудителя маслянокислого брожения. Настоящая статья имеет цель восполнить этот пробел.
Морфологию иллюстрирует рисунок, который изображает ход развития бациллы. В дополнение ее характеристики даем следующие пояснения.
Стадия 1. Короткие толстые палочки, размерами 1,5—2,0 [л на 1,2 pt с округлыми концами, с однородной плазмой. Остаются короткими в удачных культурах, когда деление происходит быстро. Такова форма молодых размножающихся клеток. По мере того как они стареют и брожение начинает ослабевать, деление останавливается и клетки переходят во вторую стадию.
Стадия 2. Более длинные клетки со вздутием посредине принимают форму Clostridium; плазма их становится мелкозернистой; они слабее окрашиваются основными красками; иодом окрашиваются в очень темный буро-фиолетовый цвет.
Стадия 3. На одном конце клетки появляется спорогенное зерно овальной формы, как у зрелой споры, но меньших размеров; метиленовая синька окрашивает его в темносиний, а остальную часть клетки в светло- синий цвет. Под влиянием иода зерно не окрашивается, а плазма принимает тот же темный цвет.
Стадия 4. Увеличившееся зерно не поддается или почти не поддается действию основных красок, но уже окрашивается по Цилю. Плазма окрашивается иодом слабее.
Стадия 5. Зерно созревает в спору, которая занимает теперь центр клетки; она окружена более светлым кольцом; иод слабо окрашивает только периферию клетки.
Стадия 6. Клетка не окрашивается иодом. Спора созревает, но содержащая ее клетка не резорбируется, как это почти всегда бывает у бацилл с эндогенными спорами. Спора заключена в слизистое вещество, которое едва окрашивается анилиновыми красками.
Стадии 7 и 8. Вероятно, вследствие разбухания этого вещества материнская клетка лопается, широко раскрываясь на одном из концов. Спора остается инкапсулированной в своего рода открытом чехлике, который можно лучше рассмотреть в почти сухом виде, удалив из препарата воду прилюмощи полоски фильтровальной бумаги. В растворе сахара без доступа воздуха споры скоро начинают прорастать, набухая. Они легко окрашиваются тогда водной метиленовой синькой или генцианом, затем спора прорастает в палочку, которая направлена в сторону отверстия капсулы.
Деление начинается сразу так, что образуется цепочка из коротких палочек, первое звено которых частью остается в оболочке споры. Споры легко увидеть в прорастающем состоянии; для этого нужно осадок мела из старой культуры внести в 2%-ный раствор сахара и рассматривать жидкость в момент начала брожения.
Морфологические свойства вида имеют, как мы видим, некоторые особенности, отличающие его от других возбудителей маслянокислого брожения.
Что касается подвижности, то мы имели случай много раз наблюдать ее главным образом в первой стадии, гораздо реже — во второй и третьей. В общем, она проявляется, повидимому, только в течение коротких промежутков времени, что не дало возможности нам окрасить жгутики.
Описанный цикл развития является до известной степени нормальным. Он встречается преимущественно в культурах в сахарном растворе, содержащем в избытке мел и лишенном или почти лишенном связанного азота, а также в аэробных условиях — под защитой посторонних аэробных форм. И, наконец, в анаэробных условиях, когда через раствор пропускается струя чистого азота.
На ломтиках картофеля или моркови, помещенных в вакуум или в баллоны для брожения, развитие бациллы видоизменяется: вместо коротких и прямых форм мы находим длинные палочки или настоящие толстые нити, порой изогнутые, как вибрионы, или даже скрученные. От таких нитей иногда отделяются кокковидные формы, которые не размножаются и не воспроизводят бациллярны^форм; форма веретена появляется на ранней стадии, но нерегулярно; спорообразование нарушается, часть клеток деградирует, не давая спор. Фиг. 3 и 4 табл. XVI воспроизводят характерную картину развития на ломтях вареного картофеля. На этих ломтях в анаэробных трубках Ру колонии имеют вид желтоватых бородавочек, издающих резкий запах масляной кислоты. На моркови появляются островки пены, сливающиеся в конце концов в сплошную белую слизь. Поддерживая условия, ведущие к такому неправильному развитию, мы видим, как ненормальный ход и сопровождающие его явления вырождения становятся все более явными: нити делаются более длинными, вздутыми; огромными, уродливыми, тогда как образование Clostridium со спорами регрессирует. Наконец, вид превращается в совершенно бесспор- ровый «выродок», в котором уже нельзя найти признаков вида. Прибавим, что он представляется также ослабленным с точки зрения усвоения азота и активности брожения. Культура в баллонах с длинным горлышком, наполненных 2%-ным сахарным раствором с прибавлением достаточного количества азота в виде пептона, аспарагина или аммиака и избытка мела, также приводит к уклоняющейся неправильной морфологии явно ненормального характера. Там часто нельзя найти ничего, кроме длинных нитей в клубках со множеством мертвых клеток без следов спорообразования. Наблюдения такого рода показывают необходимость углубленного морфологического исследования, для того чтобы получить полное представление о свойственной данному виду функции. Иначе мы подвергаемся риску начать физиологическое изучение, пользуясь вырождающейся расой; что может привести только к недостоверным результатам. Придерживаясь, как правило, работы только с нормально развивающейся расой, обильно образующей споры, мы избегли многих экспериментальных ошибок. Лучшим способом для обеспечения Clostridium нормального развития является его культура в растворе, лишенном даже следов связанного азота, причем через раствор пропускается чистый азот. Раствор должен содержать минеральных солей: Фосфорнокислого калия 1 Сернокислого магния • . . 0,2 Хлористого натра ) Сернокислой закиси железа [ Небольшие Сернокислого марганца ) количества Дистиллированной воды без аммиака 1л Прибавляем 2 % глюкозы и только что промытого в горячей воде мела в избытке. В качестве сосудов пользуемся поглотителями со стеклянными колпачками; соединяем их в ряд при помощи резиновых- трубок, так что первый поглотитель сообщается с генератором азота (по Шлезингеру), последний — с добавочным поглотителем, наполненным серной кислотой, который замыкает ряд. Склянки с культурами наполняем приблизительно только до двух третей их вместимости. После стерилизации засеваем первую склянку и пропускаем струю азота через всю систему. Когда в первой склянке начинается брожение, переливаем, нагнув поглотитель, одну каплю во вторую склянку и т. д. Медленный ток азота поддерживается в продолжение всего опыта. Такой способ дает возможность изучать сопряженные процессы брожения и усвоения азота. Культуру можно ставить и в аэробных условиях, засеяв одновременно с Clostridium соответствующие аэробные виды. В таких случаях опыт проводится в колбах с плоским дном, и раствор наливается в них слоем не выше 1 см. Развитие в них бывает нормальным, а усво- ние азота идет так же хорошо, как и в анаэробных условиях. За подробностями следует обратиться к статье III 1895 г. Переходя к химическому исследовнию сопряженных процессов брожения и усвоения азота, приведем два типичных опыта, один в анаэробных, другой в аэробных условиях. Первый опыт. Мы проводили его, пользуясь не поглотителями, а двумя большими склянками с плоским дном и широкой поверхностью (модель Фернбаха), соединенными в систему, подобную только что описанной. Питательной средой служит раствор глюкозы и чистых минеральных солей с прибавлением избытка промытого мела, образующего осадок на дне сосуда. Количество глюкозы, приготовленной по Сокслету 40 г Раствор солей - 10С0 мл Засеяно спорами 23 ноября. Ток азота. 1 декабря брожение достигает максимальной интенсивности. 13 декабря — полное сбраживание глюкозы. Для определения азота, весь осадок фильтруют, высушивают, сжигают по методу Дюма. Половина фильтрата испаряется под уменьшенным давлением в колбе Кьельдаля, и азот определяется по этому методу. Найдено: Осадок 42,3 мг азота Жидкость 11,3 » » Всего 53,6 мг азота Перегонка дает только г/3 мл маслянистой жидкости, кипящей при 108°, повидимому изобутилового спирта. Определение растворенного кальция (общая кислотность) и разделение летучих кислот (по Дюкло) приводят к следующим результатам: Отношение В/А 2,6 Уксусная кислота . 3,714 г Масляная кислота 14,164 » Всего 17,878 г (при 44,7% сброженного сахара) Масляная кислота имеет нормальное строение. Второй опыт. Слой жидкости, толщиной 1 см, налит в коническую колбу с плоским дном. Пропускание воздуха, очищенного прохождением через поглотители, наполненные серной кислотой и раствором едкого натра. Засев спорами Clostridium вместе с двумя аэробными бациллами. Чтобы ускорить начало брожения, прибавляем минимальное количество сернокислого аммония. Состав среды следующий: Глюкоза 20 г Мел 15 г Сернокислый аммоний 0,01 г Раствор солей 1000 г После исчезновения сахара производим анализ: Чистая прибыль азота 24,4 мг Отношение В/А 4 » Уксусная кислота • 1,313 г Масляная кислота 7,705 » Всего 9,018 г (или 45% сброженного сахара) 0,5 мл спирта, кипящего при 97,4° (пропиловый спирт ?). Следы молочной кислоты. Сопряженные процессы брожения и усвоения азота по существу остаются, как мы видим, теми же самыми, несмотря на разницу в условиях: с одной стороны, чистая культура при анаэробиозе, с другой — смешанная аэробная культура. В обычных для анаэробного брожения условиях мы провели несколько опытов в сахарном растворе в присутствии связанного азота с расами различного происхождения. Первый опыт. Два баллона, наполненные раствором солей с 2% глюкозы с прибавлением к одному 0,5% сернокислого аммония, к другому 0,5% пептона; мел всегда в избытке. Через месяц во втором баллоне сахар совершенно сброжен, в первом еще остаются следы его. Анализ баллона с аммиаком. Почти чистый этиловый спирт около 0,5 мг. Отношение В/А = 6,0. Анализ баллона с пептоном. Следы этилового спирта. Отношение В/А = 23,0. Сравнивая образование летучих кислот в четырех приведенных опытах: 1) без связанного азота; 2) со следами аммиака; 3) со значительным количеством аммиака; 4) с пептоном,— констатируем, что отношение В/А сильно повышается от первого опыта к четвертому. 12'34 2,6 4 6 23 Это указывает, повидимому, на стимулирующее действие азотпстого питания на образование масляной кислоты. Второй опыт. Три баллона по 2 л, наполненные 2%-ным раствором глюкозы. Азот в форме сернокислого аммония, аспарагина, пептона. Исходя из сернокислого аммония в количестве 0,5%, где отношение процента ?.зота к проценту сахара равняется 1 : 18,9, высчитываем ту же пропорцию для аспарагина и пептона; для первого — по его формуле, для пептона — по содержанию азота, которое соответствует 16%. Таким образом имеем: 1- й баллон: 0,5 сернокислого аммония. 2- й баллон: 0,568 аспарагина. 3- й баллон: 0,64 пептона. Мел всегда в избытке. Брожение в третьем баллоне продолжается 3 недели, во втором 7 недель, в первом 10 недель. Сахар сбраживается везде нацело. Анализ дает: 1) 5 мл смеси этилового и бутилового спиртов; отношение В/А = 8; 2) около 0,5 мл бутилового спирта: В/А = 4; 3) следы спирта: В/А = 5. Ответ на поставленный вопрос получается, как мы видим, отрицательный. Отношение зависит, повидимому, от еще неизвестных условий, так же как и во многих других случаях маслянокислого брожения. Газы брожения состоят из углекислоты и водорода. Отношение их подчиняется почти общему правилу, т е. процент углекислоты, слабый вначале, повышается к концу брожения; процент водорода, напротив, достигает максимума в самом начале и падает до минимума в конце. Однако в общем отношения довольно изменчивы при одних и тех же условиях, так что исключения из указанного правила нередки. Вот пример, относящийся к трем баллонам, из которых в первый прибавлено 0,25% пептона, во второй 0,25% аспарагина, в третий снова 0,25% пептона. /О /о /о В начале опыта С02 11,0 15,5 46,1 н2 89,3 84,2 54,1 В середине опыта С02 . „ . . . 40,2 52,4 51,8 н; 59,8 47,6 48,5 В конце опыта С02 54,9 55,9 52,5 Н2 45,1 44,1 47,8
Мы видим, что ход выделения обоих газов соответствует вышеуказанному правилу в двух первых баллонах, тогда как в третьем колебаний ни для одного из газов почти не заметно. Культура 3 при анализе дала: Отношение В/А 1,5 Уксусная кислота 0,3315 Масляная кислота 0,7293 Всего 1,0608 (или 42% глюкозы, количество которой равняется 2,55). Что касается распределения Clostridium pastorianum в почве, то мы всегда легко выделяли его из образцов почвы, взятых в окрестностях Петербурга. Но мы никогда не находили этого вида в многочисленных пробах с Юга России. Применяя тот же способ культуры, мы выделили бациллу по морфологическим признакам, приближающуюся к Clostridium, хотя и не идентичную с ним. Она обладает большими размерами, более удлиненными и толстыми клетками, но принадлежит также к числу маслянокислых бактерий и фиксаторов азота; ее продуктивность 2 мг азота на 1 г глюкозы. См. фиг. 6 табл. XVI. Как возбудитель маслянокислого брожения, Clostridium отличается нижеследующими свойствами.
Он сбраживает глюкозу, фруктозу, сахарозу, галактозу, инулин, декстрин. В присутствии аммиака как единственного азотистого питания его активность распространяется только на глюкозу, сахарозу, инулин. Он не способен сбраживать лактозу, арабинозу, крахмал, гуммиарабик, маннит, дульцит, глицерин, молочнокислый кальций, вещества, сбраживаемые большинством маслянокислых бактерий. Повидимому, он обладает наиболее выраженной избирательной способностью в отношении углеродистых соединений. Продуктами брожения являются масляная и уксусная кислоты, процент которых составляет 42—45% сброженного сахара; за счет остального сахара образуются углекислота и водород. Из вторичных продуктов были найдены только слабые количества спиртов и следы молочной кислоты.
Этих довольно банальных в сущности признаков достаточно все же для того, чтобы дифференцировать Clostridium pastorianum от других известных маслянокислых бактерий. Его главным отличительным свойством является способность вызывать энергичное, идущее всегда до полного разложения Сахаров брожение в безазотистой среде с усвоением свободного азота.
|
|
|
|
К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ
|
Последние добавления:
Ферсман. Химия Земли и Космоса
Перельман. Биокосные системы Земли
Вильямс. Травопольная система земледелия
Качинский - Жизнь и свойства почвы