АНАЭРОБНОЕ УСВОЕНИЕ АЗОТА

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО УСВОЕНИЮ МИКРОБАМИ СВОБОДНОГО АЗОТА АТМОСФЕРЫ

Вопросом об усвоении организмами свободного азота много занимались за последние десять лет. Он вызвал замечательные работы и возбудил горячие споры.

Полные обзоры, напечатанные на всех языках в специальных изданиях, а равно и в различных научцых и литературных сборниках, избавляют меня от необходимости распространяться здесь об истории вопроса и излагать его состояние в настоящий момент.

С другой стороны, еще не настало время, для того чтобы критика, во всеоружии достаточно точных в этой области знаний, могла правильно оценить труды различных ученых, принимавших участие в исследованиях по данному вопросу, сравнить и согласовать часто противоречивые результаты, выделить общие заключения, словом, синтезировать все известные факты.

В настоящее время необходимы главным образом новые факты, основанные на более точных и подробных исследованиях, факты микробиологического порядка. Никто не сомневается теперь, что именно за этой отраслью биологии остается в данном вопросе последнее слово.

Ряд наблюдений такого порядка, полученных более чем за два года исследований, и приводится в настоящей статье.

Прежде чем начать их изложение, мы постараемся резюмировать, по возможности кратко, результаты работ, предшествовавших нашим, останавливаясь, по преимуществу, на их биологической стороне, с тем чтобы уточнить исходную точку наших работ и их цель.

Предшествовавшие исследования касались трех классов различных низших организмов.

Бертло, которому мы обязаны столькими продолжавшимися много лет трудами по данному вопросу, пришел к заключению, что почва содержит «микробов», способных усваивать азот. Однако слово «микроб» употреблялось названным ученым вначале не в том смысле, который ему придают обыкновенно биологи. Он включал в это понятие всякие населяющие почву низшие растения: водоросли, плесени, бактерии. Особенно интересными представлялись бактерии. Он заявил, что уже некоторое время занимается исследованием их деятельности .

Анаэробное усвоение азота

Столь знаменитые по праву труды Гелльригеля и Вильфарта доказали усвоение азота бобовыми растениями, несущими на своих корнях клубеньки бактериального происхождения. Это открытие вызвало ряд работ, подтвердивших самыми разнообразными методами факт усвоения азота и необходимость симбиоза высшего растения с соответственными микробами, для того чтобы такой результат получился. Однако все усилия по изучению механизма процесса, являющегося, повидимому, очень сложным и тонким, не имели успеха. Который из двух находящихся в симбиозе видов усваивает азот? Имелись все основания приписывать эту способность микробам, но ничего доказано не было. Бейеринк, выделивший их, признал за ними совсем не ту функцию, какую ожидали. Праж- мовский и Лоран, работавшие с их чистыми культурами, стремились рассматривать их как возбудителей фиксации азота, но не могли дать никакого доказательства этого. С точки зрения усвоения азота бобовое растение и бактерии остались таким образом неотделимыми, и мы не будем стараться здесь разделять их.

Остаются, наконец, зеленые водоросли, или скорее Cyanophyceae, „ в первую очередь, Nostoc, присутствию которых в почве можно приписать усвоение азота, как хотели доказать Франк, Шлезинг и Лоран. Что наличие водорослей при известных условиях необходимо для возникновения процесса фиксации — это было поставлено вне сомнения, главным образом превосходными опытами двух последних ученых. Но то, что именно водоросли являются возбудителями этого процесса, не было доказано, так как деятельность бактерий в указанных опытах не была исключена. Действительно, Коссович  недавно выяснил, что в почве, свободной от бактерий, усвоение азота представляется невозможным.

Из нашего краткого обзора видно, что ряд таких замечательных исследований доказал только факт участия в усвоении азота известных живых организмов, бобовых, водорослей, микробов. Но каким путем они действуют и каковы их взаимоотношения? И есть ли определенный вид, которому эта функция присуща? Или последняя является всегда результатом комбинированной деятельности двух или нескольких различных организмов? Ответа не находили.

Не зная непосредственной причины процесса, нельзя было двинуть вперед его экспериментальное физиологическое и химическое изучение. Сведения о необходимых для него условиях оставались очень неопределенными: я подразумеваю его специальные условия, так как если дело идет о жйзненном процессе, то заранее известно, что он зависит от всех общих условий, необходимых для жизни: от влажности, температуры и т. п., а для микробов — и от присутствия органических питательных веществ. Что же касается специальных условий, то только изучение процесса в чистой культуре, свободной от сопутствующей микрофлоры, может дать нам представление о них.

Следя за историей вопроса в его целом, я всегда думал, что главных возбудителей усвоения свободного азота надо искать в мире микробов в собственном смысле этого слова. Несмотря на все значение бобовых, нельзя отделаться от мысли, что повсеместно распространенными возбудителями фиксации азота являются бактерии, свободно живущие в почве; ведь фиксация азота происходит за счет органических соединений, которые всегда в большей или меньшей степени содержатся в естественной среде.

Но она бедна, напротив, усвояемым азотом, так как большая часть азота, там находящегося, не может быть использована в каждый данный момент, потому что она уже входит в состав живых существ. В природе имеются огромные запасы углеродистых соединений, бедных азотом; естественно возникает вопрос, мог ли бы весь этот органический углерод быть использован и вовлечен в круговорот углерода без участия организмов, способных усваивать свободный азот. Такими организмами с двойной функцией — разложения больших количеств углеродистых соединений и усвоения в небольших дозах свободного азота, для них необходимого, могут быть только микробы: бактерии, плесени, актиномицеты.

Найти в почве определенные виды таких микробов, изобрести наиболее простые условия опыта, которые позволили бы продвинуть изучение замечательной способности усвоения свободного азота,— вот в чем заключалась главная цель моих исследований.

Я начал их в ноябре 1892 г. Они скоро привели меня к положительному результату, который я и резюмировал в сообщении, доложенном на заседании Парижской академии естественных наук 12 июня 1893 г.

Я не первый заявил о таком результате. Сообщение по тому же вопросу было сделано Бертло за шесть недель до моего (заседание 24 апреля). Он говорил, что ему удалось выделить из почвы бактерий, способных фиксировать азот.

Сожалею, что я узнал о сообщении Бертло только после того, как мое собственное уже было послано в Париж, и не мог упомянуть о нем. Бертло исправил эту ошибку, заметив после чтения моего сообщения: «каждому ясно, что оно представляет большую аналогию в отношении м е т о д а и результатов со статьей, которую я доложил около двух месяцев назад» {заседание 24 апреля 1893 г.).

С точки зрения общих результатов Бертло прав: в фактах, описанных мною, он должен видеть решительное доказательство в пользу учения о фиксации азота микробами. Но я позволю себе заметить знаменитому ученому, что дальше аналогия не идет.

Добытые факты не сходны. Мои исследования относятся к микробу, который Бертло не мог быть известен. Непосредственные результаты с бактериологической точки зрения совершенно различны, что же касается метода, то они, как будет видно, отличаются один от другого настолько, насколько вообще могут отличаться два бактериологических метода.

После изложения наших исследований мы еще вернемся к результатам Бертло.

Второе сообщение, резюмирующее результаты, достигнутые мною в 1893 г., было опубликовано в тех же «Comptes Rendus», заседание 12 февраля 1894 г.

Но они пригодны только в тех часто встречающихся случаях, когда хотя г вызвать на пита!ельной среде развитие максимального количества безразлично каких колоний, для того чтобы подсчитать их. Когда же надо в естественной среде среди множества населяющих ее организмов открыть еще неизвестный, но обладающий вполне определенной функцией вид, общепринятые методы представляются малоценными. Я говорил об этом в связи с моей работой о нитрификации и пользуюсь случаем повторить то же и теперь.

Как и в моих предшествующих работах с почвенными микробами, я сразу обратился к методу элективных культур, оказывавшему мне уже много раз большие услуги. Этот употребляемый мною здесь в первый раз термин можно объяснить несколькими словами.

Культура является элективной, когда она представляет благоприятные условия для проявления максимально ограниченной функции. Чем более узкими, в своем роде исключительными, будут-такие условия, тем благоприятнее окажутся они для обладающего данной функцией вида, который получит возможность развиваться за счет посторонних микробов, так как для последних жизнь в подобной среде станет затруднительной. Эта поддержка в борьбе за существование даст специфическому микробу в культуре такое преобладание, что легко будет открыть, а затем и изучить его.

Заметим, что в принципе данный метод представляет полную противоположность общепринятому, основанному на применении среды, считавшейся еще недавно универсальной.

Для успешного применения его необходимо:

1)        найти совокупность благоприятных условий культуры;

2)        хорошо уловить морфологические признаки преобладающего микроба, чтобы не потерять его из вида до тех пор, пока не удастся выделить его в чистой культуре, что требует часто большой дополнительной работы.

Совершенно ясно, что для получения элективной культуры в нашем случае нужна среда, совершенно лишенная связанного-азота или содержащая минимальное количество его. В то же время среда должна в изобилии заключать в себе углеродистые соединения, которые могут служить источником углерода и необходимой для развития данного микроба энергии.

Главное условие заключалось, таким образом, в применении углеродистого соединения, являющегося хорошим источником питания, но не содержащего связанного азота. Сахар, в особенности глюкоза, отвечает первому требованию, но его трудно, как известно, освободить от следов азота. Мы попытались изготовить чистую глюкозу посредством инверсии по методу Сокслета. Действительно, многочисленные анализы показали, что глюкоза, полученная указанным способом, не содержит никаких следов азота, по крайней мере определимых путем самого тонкого метода.

Напоминаю метод: 4 кг тростникового сахара растворяем в 12 л этилового спирта 90° Тернера с прибавлением 480 мл концентрированной соляной кислоты и осторожно нагреваем до 45—50°. Прибавляем немного кристаллической чистой глюкозы и даем глюкозе выкристаллизоваться при частом встряхивании. Через две недели фильтруем осадок очень мелкого кристаллического порошка, промываем водным спиртом и, наконец, еще два раза перекристаллизовываем в чистом метиловом спирте.

Вот ряд определений, произведенных по Кьельдалю со всеми необходимыми поправками.

Определение азота в глюкозе 1 мл титрованной кислоты эквивалентен 0,701 мг азота Глюкоза, г          Титр кислоты, мл

перед сжиганием после сжигания

0 (контроль)  19,6     19,2

1,0       19,6     19,2

1,5       19,6     19,2

2,0       19,6     19,1

2,5       19,6     19,1

3,0       19,6     19,1

Мы видим, что несмотря на возрастающие количества глюкозы, титр остается почти постоянным. Разницу в 0,1 мл можно не принимать во внимание вследствие сильного разведения кислоты.

Во всех опытах мы применяли всегда тот же препарат в водном растворе с прибавлением необходимых минеральных солей.

Соли были очищены путем повторной кристаллизации. Дистиллированная вода вторично перегонялась с прибавлением углекислого натрия; первые порции отбрасывались до тех пор пока дистиллят не переставал давать реакцию Йесслера; опыт повторялся каждый раз со 100 мл воды. Вода для опытов хранилась в полных бутылях с притертыми пробками.

Вся смесь составлялась следующим образом (за исключением незначительных изменений в каждом опыте):

Дистиллированная вода                  1000 мл

Фосфорнокислый калий                 1 г

Сернокислый магний                      0,5 г

Хлористый натрий \

Сернокислое железо }                     от 0,01 г до 0,02 г

Сернокислый марганец )

100 мл этого раствора получали от 2 до 4% глюкозы. Прибавлялось также обыкновенно немного чистого углекислого кальция, свеже промытого кипящей водой, во влажном виде или быстро высушенного и сохраняемого в бутылках с притертыми пробками.

Довольно часто производился для контроля анализ среды, находившейся точно в тех же условиях, как и опытные культуры.

Культуры помещались под большими, притертыми к пластинкам колпаками, в которые воздух мог проникнуть, только пройдя через пропитанную серной кислотой и едким кали пемзу. Часто применялись большие сосуды, закрытые притертыми стеклянными крышкамц с двумя отверстиями, через которые пропускался воздух, также свободный от связанных соединений азота.

Для определения азота мы пользовались преимущественно методом Кьельдаля. Он не только является самым скорым, но, когда дело идет об очень малых количествах, кажется нам и самым лучшим. Он может быть сделан очень чувствительным, если для титрования применять N/10 или N/100 растворы. Ошибки, происходящие от неизбежных загрязнении реактивов, точно определялись так часто, как это было нужно.

Мы не претендуем на то, чтобы ввести в метод Кьельдаля какие-либо серьезные усовершенствования, но нам кажется полезным, для оправдания полученных нами цифр, привести некоторые подробности хода нашего анализа.

Когда не нужно было делать никаких других определений, производилось сжигание по Кьельдалю всей культуры в целом. В таком случае мы пропускали жидкость в колбу Кьельдаля через фильтровальную шведскую бумагу, предварительно промытую в кипящей воде, и, подкислив двумя каплями серной кислоты, испаряли досуха. Осадок и фильтр, высушенные в вакууме, опускали в тот же баллон и делали определение всего азота культуры сразу.

В других случаях определяли азот отдельно в осадке (высушенном в'/вакууме) и в половине жидкости. Изредка брали для определения азота меньше половины жидкости. Очень важно было производить высушивание возможно быстро и без доступа лабораторного воздуха. Для удовлетворения этих требований мы пользовались следующим прибором, дающим возможность испарять под уменьшенным давлением четыре баллона сразу (см. 19).

Прибор состоит: из цилиндра вышиной 35 см, расширяющегося в верхнем конце и закупоренного резиновой пробкой с двумя отверстиями, в которые вставлены стеклянные трубки. Правая трубка (19) доходит до дна цилиндра, левая, короткая и согнутая, в нижнем конце закрыта ватной пробкой. Цилиндр наполнен ртутью до расширенной части. Он присоединен к двум большим колонкам с пемзой, пропитанной серной кислотой и едким кали. Колонки присоединены в свою очередь, посредством стеклянной трубки с четырьмя развилками и четырех свинцовых трубок, к четырем баллонам Кьельдаля, погруженным в сосуд из листового железа с кипящей водой. Каждая колба снабжена специальным колпачком, представляющим собою широкую трубку в виде—|. Через колпачок пропущена в баллон тонко вытянутая трубочка, конец которой в жидкость не погружается (20). Части эти соединены резиновыми трубками так, что стекло прикасается к стеклу и поверхность резины не омывается парами. Четыре колбы при помощи стеклянной трубки с четырьмя развилка

ми сообщаются с холодильником Гей Люссака, загнутый нижний конец которого опущен в толстостенную колбу, закупоренную резиновой пробкой и соединенную с водяным насосом.

Действие прибора понятно. Пропускаемый через прибор при помощи водяного насоса воздух проникает в нагретые колбы только после того, как пройдет через 32—33 см ртути и через колонки с кислотой и щелочью. Кипение происходит при давлении приблизительно в полатмосферы, и пары уносятся струей чистого воздуха.

Особое внимание надо обратить на то, чтобы в начале испарения не получилось слишком большого разрежения, так как^жидкость начинает пениться и пена может подняться до горлышка и попасть в холодильник. Для того, чтобы регулировать действие насоса и удалять пену, к правой колонке присоединена внизу Т-образная трубка с выходящей наружу толстой резиновой трубкой, которая открывается или закрывается по мере надобности винтовым зажимом.

Самые определения мы производили, применяя всегда одри и те же количества реактивов и действуя строго одинаковым способом. Каждая серия сопровождалась обыкновенно контрольным определением.

Для каждого определения по Кьельдалю мы брали 20 мл чистой серной кислоты с прибавлением 10% серного ангидрида. 0,7 г ртути, 150 мл дистиллированной воды, 75 мл раствора едкого натра (1:1), 8 мл сернокислого калия (1 :10).

Для перегонки пользовались коническими колбами из богемского стекла, в резиновые пробки которых были вставлены воронки с краном и на- 20

садки Штутцера для перегонки, усовершенствованные Обри. Дистиллят собирали в серную кислоту N\20, которую титровали раствором едкого натра, употребляя в качестве индикатора смесь лакмоида и малахитовой зелени1.

В первых опытах мы пользовались также для титрования раствором гипосульфита натрия и иодом в иодистом калии в качестве индикатора.

При точном соблюдении этих указаний и в особенности при достаточно частом повторении контрольных определений, точность метода превышает 0,1 мг.

В некоторых случаях мы производили сухие определения посредством натронной извести по методу Дюма.

Переходя к описанию моих опытов, я буду придерживаться приблизительно их последовательного порядка, что позволит дать более живую картину хода исследований и обрисовать, каким путем складывались новые понятия.

В ноябре 1892 г. несколько щепоток почвы были внесены в конические, закупоренные ватой колбы, наполненные указанным выше раствором сахара. Не было прибавлено ни углекислого кальция, ни какого-либо другого основания.

Несмотря на присутствие почвы, развития не наблюдалось довольно долго ни при комнатной температуре, ни в термостате. Через десять дней в большинстве сосудов появилось только несколько скудных хлопьев мицелия, лишенных протоплазмы и полумертвых.

Но в нескольких колбах обнаружилось брожение, сначала медленное, затем все более и более энергичное. Выделение газа происходило лишь вокруг некоторых всплывающих белых скоплений пены.

Бродящая жидкость издавала сильный запах масляной кислоты, ее реакция делалась кислой. После повторявшейся несколько раз'нейтрализации слабым раствором углекислого натрия, брожение продолжалось, не ослабевая, до полного исчезновения сахара. Когда оно заканчивалось, развивались различные плесени, покрывая белые частицы, .ставшие инертными, и в результате получались довольно обильные культуры плесеней.

Интересно было проследить дальнейшую судьбу этих культур, для чего их надо было держать на рассеянном свете. Развитие плесеней продолжалось довольно долгое время, затем тоже останавливалось; тогда маслянокислый запах исчезал, сменяясь слабым запахом плесени. И действительно, летучих кислот в жидкости больше не оставалось, и по поверхности среды распространялись зеленые водоросли.

Итак, белые скопления вызывали, повидимому, нормальное брожение, в результате которого жидкость с сахаром, лишенная усвояемого азота, становилась средой, пригодной для развития ряда низших растений.

Микроскопическое исследование белых скоплений показало, что они состояли из сплетения нитей бактерий относительно однородных, но больше всего привлекали внимание плотные массы крупного Clostridium, часто имевшего споры. Этот организм преобладал, образуя гнезда, окруженные сплетениями длинных нитей.

В молодом состоянии указанный микроб имеет форму цилиндрических палочек, прямых, шириною в 1,2 [х и в два-три раза более длинных. Никогда (кроме ненормальных случаев) не встречалось бактерий, образующих более длинные нити. Активное размножение происходит при этом состоянии клеток. Старея, клетка приобретает мало-помалу форму Clostridium, т. е. образует посередине вздутие, достигающее двойного диаметра и более, и окрашивается иодом в темнофиолетовый цвет. Спорогенные зерна появляются на одном из ее концов и превращаются в споры. Образовавшаяся спора занимает середину клетки. Вполне созревшая спора окружена слизистой капсулой, продуктом превращения материнской клетки. Треугольная капсула имеет очень резкие контуры; это — один из признаков, свойственных спорам нашего Clostridium. Величина спор составляет 1,5—1,7 pt на 1,3-1,5 pi.

Важно было хорошо заметить совокупность морфологических признаков бактерии, чтобы не потерять ее в смешанных культурах.

Далее возник вопрос о том, будет ли процесс развития в отсутствие связанного азота продолжаться при последовательных пересевах или наступят истощение и смерть.

Маленькие обрывки белых скоплений были посеяны в ту же жидкую сРеДУ без азота. Развитие начиналось всегда медленно. В половине случаев культуры совсем не удавались, неделями оставаясь без признаков роста.

Мы пытались способствовать развитию при помощи внесения следов аммиачного азота, но безуспешно. Несомненно благоприятное действие оказывало регулярное прибавление чистого углекислого кальция в виде мелкого порошка.

Так как различные плесени, дрожжи, мелкие бактерии, находившиеся в культурах, не играли, повидимому, никакой роли и отличались явно болезненным видом, мы решили избавиться от них, нагревая посевной материал в течение 10 минут до 75°. Результат оказался удачным в том смысле, что все незначительные примеси исчезли сразу, и контролировать опыты стало легче.

Тщательно исследуя эти культуры, мы нашли в них только три бактерии: 1) описанный Clostridium в сильно преобладающем количестве; 2) очень мелкую бациллу (около 0,5 р. толщиною) в длинных извилистых нитях, образующую споры в маленьких терминальных вздутиях; 3) крупную бациллу (толщиною в 2 р.) с длинными нитями, превращающимися в цепочки спорогенных клеток.

Вид культур до известной степени изменился после прибавления углекислого кальция. Плавающих скоплений пены больше не наблюдалось, засеянный обрывок оседал на слое мела на дне сосуда; появлялось серое пятно, усеянное бесчисленными дырочками, из которых вырывались пузырьки газа. Растворение охватывало мало-помалу весь слой мела, который совершенно растворялся, если он не был в избытке; и тогда вновь появлялись знакомые белые скопления, но уже в форме пленки, покрывающей все дно сосуда.

Мы проводили опыты в одних и тех же конических колбах с плоским дном, диаметром в 12 см; они помещались под большие колпаки для вакуума, через которые пропускался чистый воздух. Иногда мы применяли также сосуды вместимостью в 1,5 л с плоским дном диаметром в 20 см, закупоренные притертыми пробками, снабженными двумя стеклянными трубками, из которых одна доходила до поверхности жидкости, но не погружалась в нее. Колбы соединялись в серии по две или по три и сообщались с одной стороны с приборами, в которых очищался воздух, с другой — с аспиратором. Струя воздуха, свободная от соединений азота, медленно пропускалась через сосуды во время брожения. Толщина слоя жидкости никогда не превышала 1,5—2 см. Таким образом, развитие происходило в довольно совершенных аэробных условиях.

Я следовал указаниям ряда экспериментаторов, считающих свободный ^доступ кислорода необходимым условием усвоения азота.

С ноября 1892 г. по май 1893 г. было проведено десять последовательных серий культур. В каждую входило от трех до пяти опытных колб, каждая была засеяна лучшей из свежих культур. Наблюдаемые явления оставались в достаточной мере постоянными и не имели, повидимому, тенденции к исчезновению. Маслянокислое брожение происходило в большинстве культур; оно продолжалось обыкновенно до полного исчезновения сахара. Развивались неизменно те же организмы, Clostridium всегда преобладал.

Однако ход опытов далеко не был регулярным. Случалось, что появление новой культуры запаздывало, для возникновения брожения всегда необходим был обильный засев.

Некоторые примеры такой нерегулярности можно найти в табл. 1 в графе: «Ход и продолжительность опыта».

Эти примеры, число которых мне легко было бы увеличить, показывают, что особенно медленным и трудным бывает начало брожения.

Раз начавшись, оно идет энергично, несмотря на отсутствие азотного питания. Словом, брожение сахара без связанного азота производило, в общем, впечатление нормального явления, которое вполне по силам вызывающим его организмам, но в то же время явления трудно идущего, сложного, зависящего от многих еще неизвестных условий. В виду того, что физико-химические условия во всех опытах были постоянными, естественно было подумать об условиях биологического порядка: о необходимости гармоничного развития нескольких организмов для достижения нужного эффекта.

Понятно поэтому, что автор не стал разделять тесно связанных между собой бактерий трех видов, прочно укоренившихся в культурах, и решил продолжать с ними еще некоторое время опыты по брожению в отсутствие связанного азота.

Самый факт их существования в безазотистой среде уже показывал, что в совокупности три бациллы обладают способностью ассимилировать молекулярный азот, который один только и был в их распоряжении. Решить этот вопрос предстояло анализу.

Первые определения, сделанные в марте 1893 г., показали, что в о всех культурах, где имело место маслянокислое брожение и где были потреблены значительные количества сахара, неизменно обнаруживалась прибыль азота, тогда как при отсутствии брожения в жидкости прибыли азота совсем или почти совсем не было, даже если там и замечались единичные бактерии или плесени (табл. 1).

Замечу, что азот осадка и азот жидкости в табл. 1 имеют другое значение, чем «нерастворимый азот» или «растворимый азот»; цифры дают только приблизительное понятие, потому что профильтрованная жидкость часто бывала более или менее мутной.

Брожение или носило характер маслянокислого или совсем не имело места.

После описанных анализов уже нельзя было сомневаться, что усвоение молекулярного азота происходит в среде, совершенно лишенной связанного азота и что этот процесс есть результат жизнедеятельности ассоциации указанных микробов.

Прежде чем приступить к выяснению факторов, обусловливающих этот процесс, надо было постараться найти способ, для того чтобы облегчить опыты, сделать их более регулярными и ускорить их течение.

После целого ряда попыток я убедился, что на ассоциацию трех бацилл благоприятно действовали очень слабые дозы связанного азота и что совершенно достаточно было прибавить 2 мг аммиачного или нитратного азота для получения крайне сильного эффекта, независимого в очень широких пределах от объема жидкости и количества сахара. Большие дозы не способствовали началу брожения. Органический азот не оказывал, повидимому, никакого заметного действия.

Табл. 2 представляет собой историю нескольких культур и результаты их анализов.

Приведенные в этой таблице примеры показывают благоприятное действие минимальных доз аммиачного и нитратного азота в таких условиях. Сравнивая общую длительность культур с прибавлением количеств связанного азота, с одной стороны, и без них, с другой, мы видим, что первые затрачивают в двач раза меньше времени для потребления того же количества сахара. Но если вычесть продолжительность инкубации и сравнивать только активный период, то разница будет незначительной. В обоих случаях при хорошо идущем брожении разложение 1 г глюкозы требовало от пяти до восьми дней.

Сравнивая конечный азот культур, мы видим, что минимальные количества внесенного азота не оказывали заметного влияния на чистую прибыль азота. Эти минимальные количества только содействовали началу брожения, которое с трудом развивается в растворе, лишенном связанного азота.

Тогда возник вопрос, не окажет ли благоприятного действия на ход брожения более слабый доступ воздуха. Действительно, сразу после применения маленьких баллонов, наполненных до горлышка, начало брожения регулярно ускорялось. Но способствуя началу брожения, такой прием задерживал ход развития культур и сводил прибыль азота почти на нет; очевидно потому, что при этих условиях приток молекулярного азота становился недостаточным.

С самого начала опытов мне казалось необыкновенным, что масляно- кислое брожение может итти при почти полном аэробиозе; ведь все известные нам !^аслянокислые брожения являются анаэробными.

Прежде чем приняться за разделение бацилл, входящих в ассоциацию, я провел с ними последнюю серию опытов, чтобы выяснить действие дозы связацного азота на чистую прибыль в молекулярном азоте.

Мы видели, что минимальные дозы аммиака не оказывали влияния на конечную прибыль, но трудно было предположить, чтобы то же самое могло относиться к более значительным количествам азота.

Если конечная прибыль прямо пропорциональна количеству сахара и обратно пропорциональна количеству связанного азота, то конечный результат должен зависеть от цифрового соотношения сахара и азота. Каково будет предельное соотношение их, которое сведет прибыль к нулю?

Для изучения этого вопроса я поставил две серии опытов в одних и тех же условиях.

Первая серия. Шесть культур с одинаковым количеством сахара (3 г) и постепенно возрастающим количеством аммиачного азота.

Вторая серия. Четыре культуры с одинаковыми количествами аммиачного азота и постепенно возрастающим количеством глюкозы.

Чтобы испытать, наконец, действие значительных доз глюкозы в присутствии минимального количества аммиачного азота, способствовавшего началу брожения, мы ставили две культуры в больших склянках с плоским дном, содержащих 500—300 мл питательного раствора с прибавлением 20 и 10 г глюкозы и 2,1 мг аммиачного азота.

Все подробности опыта видны из табл. 3.

В первой серии мы повысили количество аммиачного азота с 2,1 до 21,2 мг, оставив количество сахара без изменения.

Количество в 2,1 мг, применявшееся для ускорения начала брожения, не оказало на этот раз никакого заметного действия. Когда оно было удвоено и утроено, эффект становился уже заметным. Доза, увеличенная в четыре раза, понизила прибыль азота наполовину. Наконец, количество в восемь раз большее, т. е. 17 мг азота на 5 г глюкозы, свело прибыль к нулю.

Во второй серии доза глюкозы была увеличена с 1 г до 4 г, а азот оставлен в прежнем количестве. И, как мы видим, при 10,6 мг для получения очень слабой прибыли азота необходимо было поднять количество глюкозы выше 2 г.

Цифры предельного отношения хорошо согласуются в первой и второй сериях. В первой серии фиксация была сведена к нулю при количестве азота_в 5,7 мг на 1 г глюкозы. Во второй находим почти те же цифры. Таким образом, можно принять отношение 6 : 1000. Выше этого отношения прибыль азота уже нельзя осуществить. Но, подчеркиваем, только в условиях данного опыта.

Что касается сильного повышения количества сахара, то оно, повидимому, уменьшает прибыль азота, снижающуюся до 1,5 мг на 1 г сахара, тогда как в предыдущих опытах она доходила до 2,5 и 3 мг.

Чтобы разделить смешанную культуру из трех бацилл, развившихся в аэробных культурах, мы пользовались чашками агара с сахаром без внесения азота. На них появилось два рода колоний: 1) белые лопастные колонии, опушенные бахромой из нитей в виде цепочек; мы узнали крупную бациллу, спутника Clostridium, которую мы будем обозначать а; 2) мелкие бурые колонии, состоящие из очень тонких спутанных нитей, которые будем обозначать как бациллу р.

Колонии оказались сразу же чистыми. Мы легко выделили их и начали культивировать на агаре с сахаром. Небольшие количества ^аммиачного азота способствовали их развитию, но и азота, содержавшегося в агаре,— около 0,1 %, согласно определению по Кьельдалю,— было уже достаточно для их существования.

Их роль в смешанных культурах становилась таким образом понятной. Ввиду того, что бацилла ос была строгим аэробом, а бацилла (3 факультативным анаэробом, мы пробовали получить их культуру в растворе сахара, лишенном связанного азота, но в такой культуре не обнаруживалось даже и следов роста. В отсутствие Clostridium, оба ее спутника оказались неспособными развиваться в среде, лишенной связанного азота. С другой стороны, Clostridium в чистой культуре не давал никакого роста в той же налитой невысоким слоем среде; но когда туда вносились две другие бациллы, брожение в конце концов начиналось после относительно долгого периода инкубации.

Итак, роль спутников могла считаться окончательно установленной; сам собою напрашивался вывод: анаэробный микроб может нормально развиваться в аэрированной среде в бесчисленном ряду поколений, но под защитой развивающихся аэробных микробов.

Действие двух бацилл, о которых идет речь, не имеет в себе ничего специфического. Культуры Clostridium, как мы указывали, не развивались до тех пор, пока они оставались чистыми. Но рост возобновлялся, как только в культуре появлялись посторонние организмы. Особенно, если это был мицелий, хотя и очень скудный, или бактериальная пленка, также очень слабая.

Однако, хотя присутствие аэробов необходимо только для предохранения анаэробного микроба от действия воздуха, их взаимоотношения гее же довольно сложны. Если аэробы оказывают защитное действие по отношению к анаэробному виду, то их развитие должно предшествовать развитию последнего или, по крайней мере, итти наряду с ним. Но ведь рост аэробов зависит в свою очередь от развития анаэробного вида, который один только может доставлять необходимый его спутникам азот. Отсюда понятны трудности, сопряженные с началом развития смешанной культуры. Надо, чтобы такая культура с самого начала представляла нужную комбинацию бактерий, чтобы кежду клетками ее был тесный контакт, а сами клетки были достаточно стойкими и могли вначале избежать истощения от недостатка питания. Почти естественная комбинация такого рода самопроизвольно появилась, как мы видели, в моих первых культурах: белые скопления, слегка напоминающие своей структурой крупинки кефира, каждая частица которых состояла из плотных гнезд Clostridium, окруженных нитями двух сопутствующих рас.

Словом, для того чтобы аэробный вид мог предохранять анаэробный, необходимо, во-первых, чтобы он мог противостоять, хотя бы некоторое время, цстощению, вызванному недостатком азота; во-вторых, чтобы он мог в достаточной мере поглощать кислород окружающей среды.

Я подробно остановился на явлениях этого порядка, потому что считаю их очень важными. Следует подчеркнуть, что активность нашего микроба в почве возможна только благодаря его биологическому окружению и что, экспериментируя со смешанной культурой, характер которой нам известен, мы воспроизводим ход процесса усвоения азота в' естественных условиях гораздо вернее, чем в чистой культуре, существующей лишь в наших лабораториях. Перед нами открывается широкое поле для исследований; настоящая статья является только наброском его.

Возвращаясь к Clostridium, скажем, что нам удалось выделить его на ломтиках вареной моркови, помещенных в трубки Ру, которые мы запаивали после откачивания воздуха.

Мы ставили опыты с чистыми культурами Clostridium в больших склянках с плоским дном. Две из них, соединенные резиновой трубкой, сообщались с одной стороны с генератором азота, с другой — с поглотителем, наполненным разбавленной серной кислотой, и аспиратором. Чистый азот изготовлялся по методу Шлезинга: воздух пропускался через пемзу, пропитанную серной кислотой, и пемзу, пропитанную едким кали, а затем через медные стружки, заключенные в стеклянную или металлическую трубку длиною в один метр, которая нагревалась докрасна. Два поглотителя с серной кислотой и раствором едкого натра заканчивали цепь. Протягивание азота продолжалось по два часа ежедневно. Опыты проводились при 30°. В табл. 4 приведены данные о составе, ходе и продолжительности опытов с культурами, а также цифры по определению усвоенного азота.

Энергия брожения была исключительной: разложение грамма сахара занимало только два дня. Что касается прибылей азота, то их абсо.- лютная величина значительна, если принять во внимание время. Но отношение усвоенного азота к сброженному сахару не более благоприятно, чем прежде,— оно равняется 1,5 и 1,8 : 1000 и остается ниже отношения, установленного для смешанных аэробных культур, где отношения часто превышали 2,5 : 1000.

Словом, последние опыты дают нам окончательное решение поставленного нами перед собой вопроса. Мы открыли в почве определенный вид бактерий, способный синтезировать азотистые соединения за счет молекулярного азота, и доказали, что он проявляет эту редкую функцию в совершенно чистой культуре. Фиксированный азот мы нашли главным образом в нерастворимом виде, но и растворимый азот поокончании брожения составлял около 20% общего количества.

Нам не удалось идентифицировать выделенный нами Clostridium ни с одной из известных маслянокислых бактерий, большинство которых, правда, еще недостаточно изучено. По своим морфологическим свойствам он ближе всего стоит к Clostridium butyricum Пражмовского, однако отличается от последнего в достаточной мере, для того чтобы рассматривать его как новый вид. Мы даем ему название Clostridium pastorianum.

Несмотря на полученные решающие результаты, некоторые отклонения в функциях данного организма требовали дальнейшего разъяснения. Наш Clostridium проявил себя как хрупкий организм, склонный давать инволюционные формы, что вызывало частые нарушения правильного хода опытов.

Эти нарушения привлекли наше внимание еще к одному обстоятельству общего значения. Возник вопрос физиологического порядка, требовавший определенного ответа. Существует ли организм, который может жить нормально в течение неограничен н%о го ряда поколений без азотного питания за счет атмосферного азота? Доказано, что Clostridium может жить так последовательно в нескольких поколениях. Но его явно ненормальный вид, который обнаруживался иногда в чистой культуре, вызывал вопрос, может ли усвоение молекулярного азота удовлетворять его потребность в питании в течение очень длительного времени.

Последующие морфологические наблюдения не оставляли никакого сомнения в реальности явлений дегенерации. Нормальными морфологическими признаками микроба являются, как мы уже говорили, форма цилиндрических палочек во время активного размножения (форма бациллы), клетки, раздутые наподобие веретена (форма Clostridium, окрашиваемая иодом) со спорогенным зерном на одном из концов, переходящим в спору; наконец, зрелые споры, снабженные характерными чехликами. Но случалось, что уклоняющиеся формы, появлявшиеся в культурах, делали эту нормальную морфологию неузнаваемой. Вместо описанных фаз мы наталкивались на длинные палочки, на изогнутые, закрученные нити, несущие иногда округлые кокковидные образования на концах, на вздутые, уродливые клетки, слишком длинные и слишком толстые, местами на начало спорообразования, выражавшееся в спорогенных зернах, не превращавшихся в нормальные споры. Незавершенное спорообразование является самым характерным симптомом дегенерации Clostridium. У меня были целые серии культур, в которых спорообразование уменьшалось все больше и больше, до тех пор пока раса не превращалась в совершенно аспорогенную. Контраст между такими вырождающимися формами и формами нормального развития, кончающегося обильным образованием спор, был поразителен.

Подобные явления дегенерации вызываются всяким неблагоприятным влиянием, действующим хронически.

Особенно в тех случаях, когда культуры находились в атмосфере азота, напрашивался вопрос, достаточно ли давление этого газа для потребностей микроба, так как в этих условиях газ проникает в клетки только путем диффузии через жидкость, насыщенную газами брожения. Казалось, что лучше пропускать азот через жидкость непрерывно. Я и стал делать это, пользуясь для опытов поглотителями с притертыми колпачками, снабженными двумя трубками, одна из которых доходит до дна.

Мы изготовляли целую серию их и стерилизовали, наполнив на три четверти раствором сахара и надев на стеклянные трубки каучуковые, которые должны были служить для соединения их в ряд.

Что касается до засева новых серий, то я решил ликвидировать все старые культуры ненова выделить бацилл непосредственно из почвы. Впрочем, прямой путь для выделения Clostridium еще предстояло найти. Были основания предполагать, что новый способ культивирования, при соблюдении с самого начала анаэробных условий и при обильном доступе газообразного азота, легче приведет к цели.

В апреле 1894 г. следы почвы были внесены в первую склянку ряда и через нее мы сразу же стали пропускать днем и ночью струю чистого газа. Через три дня при комнатной температуре в ней началось очень энергичное брожение. Микроскопическое исследование обнаружило, что получил развитие в жидкости только один уже знакомый нам Clostridium„ С первого взгляда культура показалась чистой. Но она еще не была такой в точном смысле слова. Однако этот факт следует отметить, так как он указывает на большую элективность условий, что очень облегчает обыкновенно окончательное освобождение культуры от посторонних примесей.

В течение 75 дней мы дошли до двадцатого пассажа, перенося каплю жидкости иЗ склянки с брожением в новую склянку без разъединения их. Струя азота пропускалась беспрерывно, количество его мы старались регулировать по числу склянок с брожением. Мы держали культуры в лаборатории, температура которой не превышала 18—20°.

Относительно хода развития культур наши предположения всецело оправдались. Брожение начиналось регулярно через 24—48 часов после засева. Раз начавшись, оно шло, не останавливаясь, до полного разложения сахара. С увеличением числа пассажей не было заметно никакого ослабления активности брожения. Наконец, морфологические признаки Clostridium представляли типичную картину без уклоняющихся форм.

В этой серии с двадцатью пересевами мы не обращали внимания на чистоту культур. Мы намеренно избегали всякого вмешательства в ход развития бактерий: 1) чтобы узнать, не образуется ли какой-нибудь интересной ассоциации микробов; 2) чтобы выяснить, возможно ли получить чистую культуру исключительно путем пересевов в таких условиях.

В смысле ассоциаций не было найдено ничего интересного, и точно так же не было открыто в пробе почвы никакой другой бактерии, способной усваивать свободный азот, кроме Clostridium pastorianum. Вначале в культурах развивался исключительно Clostridium, только к концу пересевов, появлялась посторонняя бацилла, имеющая форму длинных извилистых нитей, в'которой мы узнали спутника (3. Кроме него в старых культурах замечалось слабое развитие мелкой бесспоровой бактерии. Нагревание образовавших споры культур до 80° позволило легко освободиться от нее. Мы выделили тогда Clostridium на ломтиках вареного картофеля, натертых мелким порошком мела, поместив их в вакуум.

Колонии имеют вид небольших желтоватых скоплений, не превышающих 1 мм в диаметре. Ломтики без мела выделяют резкий запах масляной кислоты.

Таким образом, самый быстрый способ выделения данного вида из почвы состоит в следующем: 1) посев следов почвы в лишенный связанного азота сахарный раствор, через который пропускается струя чистого азота; 2) несколько пассажей в той же среде; 3) нагревание совершенно- зрелых спор при 80°; 4) ломтики картофеля, содержащиеся без доступа воздуха.

Добавим, что Clostridium, засеянный в чистой культуре в мясной бульон или на питательную желатину без доступа воздуха, не развивается.

Если культура Clostridium частая, то среды должны оставаться без изменения.

Определения азота производились в серии с чистыми культурами, засеянными в поглотители. На табл. 5 приведены все подробности опыта.

Из нее видно, что усвоение азота в чистой культуре не отличается чем-нибудь особенным. Прибыли азота остаются приблизительно теми же, что и раньше, так же как и отношение усвоенного азота к сброженному сахару.

Культуры, занимавшие последние места и получавшие газообразный азот в смеси с газами брожения, фиксировали меньше азота, чем те, через которые проходил более чистый азот.

Заметим, что слабые количества аммиака уносятся струей газа; они удерживаются титрованной кислотой в последней склянке. В некоторых опытах это количество аммиачного азота достигало 2 мг. 4

Как возбудитель маслянокислого брожения Clostridium характеризуется следующими признаками.

Продуктами его брожения являются масляная и уксусная кислоты, причем первая сильно преобладает. Определения по методу Дюкло дали отношение — уксусная кислота: масляная кислота = 1 : 4 и 1 : -3. Масляная кислота имеет нормальное строение.

Следы высшего спирта. Отсутствие нелетучих кислот.

Газы брожения: водород и углекислота; содержание первого доходит до 60—75%.

Нам остается сравнить наши результаты с результатами Бертло, упомянутыми в начале нашей статьи.

Названный ученый приходит к заключению, «что существуют микроорганизмы весьма различных видов, способные фиксировать азот, главным образом некоторые почвенные бактери и». Он считает, что выделил нескольких из них с помощью Гиньяра, применяя самый обычный метод. Все выделенные микробы хорошо развивались в мясном бульоне («сильная муть через два часа при 20°»), два вида из четырех быстро разжижали желатину. То были, вероятно, банальные зародыши, разлагающие белковые вещества.

Clostridium, как мы видели, ведет себя на таких средах совершенно .иначе. Обычно виды, приспособленные к жизни в среде, бедной усвояемым азотом, плохо переносят среду, богатую белками.

Не буду скрывать, что метод, которым пользовался Бертло для открытия усваивающих азот микробов, показался мне весьма сомнительным. Я счел все же долгом проверить метод специальными опытами.

Я взял для этих опытов несколько проб почвы из разных мест.

Первая серия. Два вида бактерий были выделены из почвы на питательной желатине и на картофеле в аэробных и анаэробных условиях, и чистые колонии были засеяны в мясной бульон. Культуры на последней среде послужили для засева колб с сахарным раствором без азота.

Во все культуры прибавляется минимальная доза органического- азота в виде пептона, что доводит поправку до 0,8 мл (включая реактивы, посевной материал, прибавленный азот).

Две культуры получают сернокислый аммоний — поправка 1,8 мл.

Мы видим, что развитие было очень скудным и что некоторая прибыль получилась только у рас, выделенных на картофеле, особенно у смешанной культуры /, к, но там был найден Clostridium и обнаружено масляно- кислое брожение.

Вторая серия. Мы выбрали виды первой серии, которые были лучше приспособлены к условиям культуры в сахарном растворе со слабой дозой усвояемого азота. Прибавили к ним еще пять, выделенных на желатине. Серия включала три опыта по семи культур и, в качестве контроля, еще два со смесью культур /, к, i.

Первый о п ы т. Минимальное количество пептона. Общая поправка 0,8 мл. Количество сахара 1,2 г.

Второй опыт. Количество сернокислого аммония, эквивалентное 2,1 мг аммиачного азота, сахара 1,5 г.

Третий опыт. Исходный азот отсутствует. Поправка 0,4 мл. Количество сахара 1,2 г.

Табл. 7 дает все подробности опытов.

На основании данных, полученных в двух сериях, можно сделать следующие выводы.

1.         Ни один из пятнадцати видов бактерий различного происхождения не обнаружил способности усваивать молекулярный азот в сколько-нибудь заметных количествах. Ничтожные прибыли, констатированные у немногих культур, не достигали 0,5 мг. Только маслянокислая бактерия, на которую мы снова натолкнулись, дала под защитой спутников прибыль азота того же порядка, что и раньше.

2.         Микробы, выделенные на желатине, оказались неспособными утилизировать сахар вследствие недостатка подходящего азотистого питания.

3.         Из числа выделенных на картофеле микробов два, кроме ClostridiumT дали некоторую прибыль азота в присутствии следов органического азота. Прибыль эта была незначительна по сравнению с прибылью у ClostridiumT даже если не вводить поправку на время.

4.         Ни один вид не мог нормально развиваться в среде, лишенной связанного азота. В этом отношении открытый нами в почве организм доныне остается единственным.

Соблюдая осторожность, мы можем, в ожидании дальнейшего прогресса исследований в данной области, ответить только отрицательно на поставленный в начале настоящей статьи вопрос: распространена ли в мире микробов способность к усвоению азота? Нет, не распространена. Она представляется специфической. Мы пробовали самые разнообразные способы и исследовали много образцов почвы, но нашли только одну анаэробную маслянокислую бактерию, которая с несомненностью обнаружила способность к усвоению азота.

Итак, положение Бертло, «что существуют очень различные микроорганизмы, способные усваивать азот», не нашло подтверждения в опытах, описанных в настоящей статье, и для выяснения этого капитального вопроса следует пользоваться не его методом.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ