НИТРИФИЦИРУЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

О МЕТОДЕ

Общие положения.

Начнем с метода, который 40 лет назад привел к открытию нитрифицирующих бактерий. Совершенно ясно, что он мог быть только таким, каким был. Очень продолжительный период элективной культуры в растворе — или культуры обогащения,— сопровождавшийся микроскопическими исследованиями и химическими анализами, был необходим для получения точного понятия о том, что представляли собой в отношении формы и функции эти столь упорно отыскиваемые бактерии. Установив предварительно их свойства, надо было выделить расы в безупречно чистом виде. После окончательного выделения чистый культур, изыскания были направлены на физиологические свойства, в особенности, на хемосинтез и на отрицательное отношение к органическим питательным веществам.

Но теперь, когда характер бактерий установлен и проверен, незачем вновь проделывать этот пионерский путь, столь долгий и трудный.

Как один из авторов настоящей статьи констатировал уже несколько раз, так называемые культуры обогащения не только бесполезны при выделении из почвы специфических микробов, но даже мешают такому выделению. Что касается специально наших бактерий, то их плотность в почве часто не превышает одного или нескольких тысяч зародышей или групп зародышей на 1 г почвы, а нередко она спускается й до сотен. Таким образом, эти зародыши в своей естественной среде рассеяны настолько, что видимый для простого глаза комочек почвы содержит их очень мало. Может ли быть лучший способ для выделения их, чем помещение такого комочка прямо на плотную элективную среду, где сразу же начинается развитие бактерий в достаточной мере однородных? Часто выделение практически происходит при первой же попытке и остается только проконтролировать его.

Напротив, засеяв жидкую среду одним или несколькими граммами почвы, чтобы вызвать там развитие специфической микрофлоры, мы рискуем найти смешанную микрофлору с разного рода спутниками, от которых в той же среде освободиться трудно. Чаще бывает, что спутники приспособляются к условиям среды и удалить их становится еще труднее. Если при помощи тонких технических приемов и удается иногда отделаться от спутников, то дифференцировать расы, обладающие одинаковой функцией, почти невозможно. Вот почему одному из нас при его старых исследованиях, удалось найти в различных пробах почвы только один вид нитритных бактерий и один вид нитратных.

При помощи простого способа, который мы сейчас опишем, можно, наоборот, достигнуть довольно скоро дифференциации и выделения отдельных рас в достаточно чистом виде для опытов с нитрификацией. Чтобы убедиться в этом, не надо никакого специального исследования.

Впрочем, при желании освободить специфические зародыши от всяких следов бактериальных «сорняков», ничто не мешает проверить чистоту культуры на бульоне или при помощи микроманипулятора.

Приготовление чашек. Так как образование конечных продуктов было всегда незначительным, а колонии были плохо видимы, то в голову, естественно, пришла мысль воспользоваться растворяющим действием нитро- зобактерий на карбонатные основания, для того чтобы сделать их колонии заметными. Принцип метода, некоторые общие указания на приемы и достигнутые результаты, мы уже изложили вкратце в двух сообщениях 1929 г. [43]. В первую очередь применяется углекислый кальций, во вторую,— углекислый магний; иногда предпочтительнее смесь обеих солей, фосфорнс-аммонийно-магнезиальная соль с примесью углекислого кальция может служить для той же цели; ее применение упрощает манипуляцию, делая ненужным предварительное пропитывание кремнекислого геля аммиачной солью. В последнем случае, однако, колонии различить труднее, поверхность зоны растворения бывает усыпана кристаллами, что мешает диагностике.

Для нанесения эмали на чашки с нитритами, где не должно быть, разумеется, никакого растворения, мы применяем порошок промытого медицинского каолина; о преимуществах его будем говорить ниже. -

Все указанные соединения должны покрывать пластинки кремнекислого геля в виде гладкого слоя без каких бы то ни было комков, что требует большого внимания. На поверхности геля должна быть белая сухая эмаль без следов излишней влажности. Запас нужных соединений, стерилизованных в автоклаве, мы сохраняем в стеклянных банках.

Состав раствора солей:

Фосфорнодвукалиевая соль                       0,5 г

Сернокислый магний                      0,3 »

Хлористый натрий                          0,3»

Сернокислая закись железа                        0,02 »

Сернокислый магний                      0,02 »

Соли цинка, молибдена, титана, алюминия            Следы

Дистиллированная вода                  200 мл

 Раствор сернокислого аммония содержит 50 мг соли на 1 мл. Берем: На чашку, диаметром 10 см: 2 мл раствора солей и 1 мл аммиачного раствора. На чашку, диаметром 20 см: 10 мл раствора солей и 5 мл аммиачного раствора, Прибавляем минимальное количество дистиллированной воды, кипятим, выливаем на чашку, даем жидкости с поверхности испариться, оставляя чашки открытыми на металлической доске, нагретой приблизительно до 50°, и только тогда начинаем эмалировать, во избежание потери аммиака, особенно при применении соли магния Для того чтобы нанести эмаль, берем 1 г углекислого кальция или 0,5 г углекислого магния на чашку, иногда прибавляя к последнему несколько сотых грамма углекислого кальция. Для больших чашек берем количества, увеличенные в пять раз. Взвешиваем в маленькой чашке, переносим в ступочку, прибавляем минимум, дистиллированной воды и очень тщательно растираем смесь так, чтобы при наклонении ступки во все стороны в молочной жидкости нельзя было обнаружить ни малейших комочков. Выливаем тогда взвесь на чашку и даем испариться второй раз.

Если посев производим суспензией, то нужное количество ее наливаем на чашку сразу после молочной жидкости и хорошо перемешиваем их, вращая чашку. Вторичное просушивание производим при температуре не выше 35°. Стараемся, по возможности, сократить нужное для этого время, избегая излишка воды. Обыкновенно высу-< шивание занимает немного больше часа. После его окончания проверяем, не остается ли в слое еще излишней воды, которая может нарушить эмаль.

При засеве комочками почвы, располагаем около 150 комочков начашко ® Ю см правильными рядами и на одинаковом расстоянии друг от друга, ^сли хотим посеять на чашку определенную навеску почвы, то некоторое

ее количество (предварительно определив процент ее влажности) взвешиваем в тигле Гуча вместе с блюдечком и крышкой, затем рассыпаем понем-^ ножку нужное количество на всю поверхность чашки; вторичное взвешивание покажет вес засеянной почвы.

Для окисления в нитраты на чашку в 10 см берем 0,5 г порошка каолина с прибавлением нескольких сотых грамма углекислого кальция, 2 мл раствора солей, 1 мл (30 мг) раствора азотистокислого калия; на чашку в 20 см нужны в пять раз большие количества. Все это смешиваем в колбе, нагреваем до кипения, переносим на чашку, даем испарргться.

Порошок каолина, смешанный с небольшим количеством мела, прибавляется для того, чтобы колонии были лучше видны. Они гораздо заметнее на белой поверхности, чем на бесцветном геле, так как имеют вид прозрачных стекловидных капелек или желтоватых пятен.

Скажем раз навсегда, что при всех этих манипуляциях опасность заражения совершенно исключена, так как в воздухе нет зародышей иитрифи- каторов, а банальные зародыши в данном случае не имеют значения. Стерилизацию,особенно в автоклаве, можно, следовательно, сильно сократить, не боясь испортить результаты.

При изучении окисления в нитриты мы пытались несколько раз заменить кремнекислый гель агаром. Это нам никогда не удавалось. Окисление в нитриты, судя по реакции, правда, происходило, но чрезвычайно медленно и без образования достаточно заметных зон растворения. К этому прибавлялась еще трудность, связанная с длительным хранением чашек; в конце концов на них неизменно появлялись плесени.

Дифференциация и выделение рас. Макроскопическое и микроскопическое исследование.

Вызвать образование данными организмами видимых колоний невозможно, и поэтому чашки, покрытые эмалью, представляют то громадное преимущество, что развитие нитрозобактерий на них очень заметно, а для обнаружения их функции не требуется никакой проверки: ведь только нитрозобактерии способны растворядъ карбонатное основание на минеральном геле с аммиачной солью в качестве единственного энергетического вещества. Снимая иглой с прозрачных пятен бактерии, мы можем непосредственно изучать их развитие и делать дальнейшие пересевы.

Когда дело идет о выделении нитрозобактерий из почвы, мы начинаем всегда с чашек, засеянных комочками почвы, как указано выше. Лучше приготовлять для каждой пробы две чашки: одну, покрытую эмалью из углекислого кальция, другую — из углекислого магния; разница в рН часто вызывает преимущественное развитие различных рас. Через пять- шесть дней, если почва активна, а в противном случае дней через пятнадцать, вокруг комочков появляются прозрачные зоны, где вследствие растворения поверхностного слоя обнажается гель (см. рис. 8). Изучаем прозрачные зоны при помощи лупы; они уже могут представлять некоторые различия, в общем мало заметные, но достаточные для первой дифференциации; поверхность их бывает или покрытой стекловидной слизью, или сухой, или похожей на шагреневую кожу; иногда она усыпана кристаллами или усеяна своего рода бородавочками и т. п.; места растворения представляются то бесцветными, то окруженными сероватым или желтоватым ободком. Мы выбираем несколько таких зон и'подвергаем их микроскопическому исследованию.

Для получения препарата прикасаемся кончиком прямой или согнутой в петлю платиновой иглы к поверхности зоны и переносим иглу в маленькую каплю воды на предметном стекле; затем распластываем препарат в маленький кружок размером 2—3 мм; распределять его на большей поверхности не следует, ибо препараты и так бывают обыкновенно довольно бедными. Высушиваем, фиксируем абсолютным спиртом, быстро сжигаем излишек.

Что касается красок, то лучше всего пользоваться 1 %-ным раствором сульфовиолета в 5%-ной карболовой воде. Он одинаково пригоден как для нитритных, так и для нитратных бактерий.

Пересев рас и чистая культура

Таким образом, мы производим микроскопическое исследование, оставив в стороне всякую мысль об изменчивости бактерий, не говоря уже о теории жизненных циклов. Каждая колония, состоящая из однородных клеток, сильно отличающихся по форме и размеру от клеток других бактерий, рассматривается как автономная раса. Последующие пересевы культуры покажут, насколько ее признаки постоянны.

Пересев делаем всегда на пластинки кремнекислого геля, покрытые эмалью углекислого кальция или магния. Захватываем колонию, разбалтываем ее в 10 мл прокипяченной водопроводной воды (первое разведение); отсюда 1 мл переносим в другой сосуд с таким же количеством воды. Второго разведения обыкновенно достаточно для получения нужного разбавления. Иногда, впрочем, приходится делать до четырех разведений.

Прозрачные зоны появляются через 7—10 дней. Как только они достигают размера приблизительно двух миллиметров, подвергаем их микроскопическому контролю, чтобы установить, развилась ли искомая форма- Если развилась, то без замедления приступаем к второму пересеву, ибо необходимо устранить нитратные бактерии. Иногда это удается сразу, если момент для пересева не упущен. Дело пойдет иначе, если пересев будет сделан слишком поздно и аммиак, мешающий развитию нитратных бактерий, изчезнет. Во всяком случае уда лить последних всегда легко удается. Химический контроль, возобновляемый время от времени над первой или над первыми культурами, показывает, что такое устранение действительно имело место, если количество нитритов остается постоянным.

Чтобы убедиться в чистоте культуры, достаточно подвергнуть тщательному микроскопическому исследованию несколько появившихся колоний. Картина должна быть безупречно однородной; если среди бактерий попадаются еще бактериальные «сорняки», то их легко узнать по их палочковидной форме и почти полной бесцветности, так как они не окрашиваются при помощи сульфовиолета. Чтобы составить представление о степени загрязнения, лучше всего рассматривать окружность высохшей капли, всегда более богатую бактериями. Если не находим в препарате ничего постороннего, считаем культуру чистой; если видим отдельные, далеко отстоящие друг от друга посторонние бактерии, все же признаем культуру в достаточной степени очищенной для опытов по нитрификации. Эти немногие посторонние зародыши при следующих пересевах не развиваются, а скорее исчезают. Все же для последовательных пересевов лучше выбирать колонии, которые можно считать чистыми. Они-то и служат для изучения морфологических и физиологических признаков отдельных рас.

Чтобы поддерживать культуру, следует пересевать ее путем нанесения капелек взвеси на эмалированную поверхность пластинок при помощи платиновой иглы; капельки растекаются, не повреждая слоя эмали (рис. 13). После наступившего развития микрофлоры чашки сохраняют при комнатной температуре, поместив их крышками вниз в большие чашки (диаметром 25 см и глубиною 7 см), в каждую из которых входят 12 чашек и глоское блюдечко, наполненное водой. Гель сохраняется в хорошем виде в течение нескольких месяцев и даже года. Нйтрификаторы остаются вполне жизнеспособными; никакой посторонней микрофлоры не появляется. Чашки достаточно пересевать два раза в год, не забывая разумеется, необходимости возобновлять запас воды в больших чашках которые играют роль влажных камер.

Химический контроль. Говоря здесь о химическом контроле, мы желаем только напомнить, что он может дать точные результаты при применении его в самом упрощенном виде. Сверхчувствительные реактивы, крайне ценные для контроля питьевых вод, вроде реактива Петер — Грисса, в этом случае должны быть оставлены, потому что они мешают следить за ходом нитрификации, открывая такие следы, которые не имеют к ней никакого отношения. Мы придерживаемся поэтому реактива Троммсдорфа, сернокислого дифениламина, и жидкости Несслера для качественных опытов. Контроль производим по старому способу, т. е. захватываем из жидкой культуры при помощи платиновой петли каплю, не превосходящую г/50мл и опускаем ее в 2—3 капли реактива. Пластинки с кремнекислым гелем проверяем тем же способом, т. е. вырезаем кусочек геля, величиной с хлебное зерно, и опускаем его в реактив. Большим преимуществом такого приема является возможность следить шаг за шагом за ходом процесса, даже в количественных опытах, с ничтожной потерей вещества. С реактивом Троммсдорфа 2 мг нитритного азота на литр дают легкую синюю дымку, 6 мг — синее пятно, 18—20 мг — темносинее пятно. Поступая таким же образом с реактивом Несслера, получаем ржавое пятно при 60 мг аммиачного азота на литр, желтое — при 25 мг, бледножелтую дымку— при 10 мг на литр.

Для количественных определений, связанных с изучением данных бактерий, единственным методом является титрование пермаиганатом. Пользуемся приблизительно iV/Ю раствором, выдержанным, с установившимся титром, который определяется по классическому способу с щавелевокислым аммонием. Приготовляем раствор азотистокислого калия (чистый для анализа), который был бы совершенно эквивалентен раствору перманганата. Мы применяли раствор, содержавший 0,67 мг нитритного азота на 1 мл. Его титр не меняется при хранении.

Жидкую культуру доводим до 100 мл, берем пипеткой определенную часть и переносим в избыток раствора перманганата с прибавлением серной кислоты. Кончик пипетки держим погруженным в перманганат, и раствор, медленно спускаем, помешивая кончиком пипетки. Затем титруем раствором нитрита, причем кончик бюретки попрежнему Держим в растворе перманганата, регулируя вытекание так, чтобы оно становилось все медленнее и не превосходило к концу, когда жидкость сделалась розовой, одной капли в минуту вплоть до обесцвечивания. Произведенные таким способом определения имеют точность до 1/ю мл-

Этот метод служил для опытов по окислению до нитритов и по окислению до нитратов в зависимости от рН, которые создавались в растворе. При окислении до нитритов выход будет прямо пропорционален объему обесцветившегося перманганата, при окислении до* нитратов этот объем указывает на количество оставшегося не окисленным нитрита и, следовательно, пропорциональность будет обратной.

Процесс нитрификации как функции рН. В таком опыте трудность заключается в том, чтобы составить достаточно длинную гамму рН,

например, от 5,0—5,5 до 9,5, и достаточно стойкую, не подверженную никаким самопроизвольным изменениям, вне воздействия бактерий.

Гаардер и Хагем думали преодолеть эту трудность, регулируя рН при помощи буферной смеси фосфатов, которые они прибавляли в постепенно возрастающих дозах так, чтобы получилась гамма от 10 до 12 ступеней в указанных пределах. Они убедились посредством предварительных опытов, что максимальные количества буферной смеси не угнетают процесса нитрификации. Все же они заметили, что в таких условиях процесс протекает далеко не с такой быстротой, как в присутствии карбонатных оснований, которых они не вносили. По этой-то причине, вероятно, их опыты и шли очень медленно.

Предварительные опыты показали нам, кроме того, что оптимумы заключены не в такие узкие границы, чтобы опыты надо было производить непременно с 10—12 ступенями; это только бесполезно усложняет работу.

Достаточно шести ступеней, а именно: 1) рН ниже 6,0; 2) от 6,0 до 6,6; 3) от 6,8 до 7,2; 4) от 7,4 до 7,8; 5) от 7,8 до 8,6—8,8; 6) от 8,8 до 9,2.

Гамму следует регулировать при помощи трудно растворимых в воде карбонатных оснований с прибавлением нескольких капель соляной кислоты и углекислого натрия.

Мы опишем только окончательную комбинацию, принятую нами после многих исканий.

Приготовляем два одинаковых раствора с той только разницей, что раствор I содержит одноосновный, а раствор II — двуосновный фосфат.

Фосфорнокислый к^лий (одно- или двуосновный)                       0,5 г

Сернокислый магни^ »                   0,3 »

Хлористый натрий ...»                    0,3 »

Сернокислое железо                        0,02 »

Сернокислый марганец                   0,02 »

Водопроводная вода            1л

Вместо дистиллированной воды берем водопроводную воду (ключевую) не только потому, что она имеет более высокий рН, но и потому, что она заключает в» себе следы различных минеральных веществ, которые в бесконечно малых количествах могут благоприятно влиять на ход микробиологического процесса. Ввиду того, что опыты ведутся на чистых культурах, следы органических соединений, которые могут находиться в этой воде, не представляют собой помех.

Пользуемся маленькими коническими колбами с плоским дном диаметром 7 см. Распределяем нерастворимые карбонаты по колбам и стерилизуем в автоклаве, не наливая в колбы жидкости,— необходимая предосторожность, так как стекло может повысить щелочность перегретой воды в достаточной мере, для того чтобы вызвать в некоторых колбах изменение рН. Нужное для всей серии количество раствора стерилизуется отдельно в колбе с пипеткой, емкостью 20 мл, а раствор 1,5%-ного сернокислого аммония — в колбе с пипеткой на 1 мл. Распределяем их но колбам: на каждую по 20 мл раствора I или II и 1 мл аммиачного раствора, т. е. 15 мг сернокислого аммония. Три первые ступени получают раствор I, три последние—раствор II. В колбы с этими растворами прибавляем:

№ 1. Мрамора 0,1 г в виде 4 кусочков. Соляной кислоты N/4, шесть капель для получения рН == 5,2.

№ 2. Мрамора 0,5 г в виде 16 кусочков. Соляной кислоты N/4, пять капель для получения рН = 6,0.

№ 3. Мрамора 1 г в виде 24 кусочков для получения рН — 7,1.

№ 4. Мелу в порошке 0,5 г для получения рН = 7,6.

5. Углекислого магния 0,1 г для получения рН = 8,7.

№ 6. Углекислого магния 0,3 г. Порошок мелу 0,01 г. N/1, раствор углекислого натра, 2 капли для получения рН = 9,2.

Оставляя серию для контроля в термостате в продолжение шести дней, определяем ежедневно рН колориметрическим способом и констатируем, что

в № 1 рН повышается очень медленно, оставаясь все время ниже 6,0 и достигая этой величины только на шестой день;

в № 2 — еще более медленное повышение с достижением 6,5 на тот же день;

в № 3 — незначительное повышение до 7,3;

в № 4 — отсутствие изменения;

в № 5 — то же;

в № 6 значительное понижение, так что для поддержания рН на 9,1—9,2 необходимо каждые 24 часа прибавлять две капли раствора 7V/1 соды.

В общем, если при таких условиях полной устойчивости рН получить и нельзя, то изменения держатся все же в предусмотренных границах.

Кроме того, надо наблюдать за потерями аммиака в ступенях"с высоким рН, № 5 и 6.

Такая потеря может достигать за шесть дней пребывания в термостате 50% всего внесенного количества и даже выше. Необходимо, следовательно, прибавлять слабые дозы аммиака, когда проба дает в реактиве Несслера только бледную дымку.

Несмотря на все старания и на буферность раствора при избытке оснований, нам не удавалось вполне предотвратить изменения рН в кислую сторону под влиянием окисления в нитриты. Углекислый магний обеспечивал устойчивый рН, а мел не всегда; изменение рН нельзя было приписать углекислоте, которая исчезала при кипячении перед колориметрическим определением. Но изменение всегда было незначительно и лучшим средством его предупреждения служило применение меньшей дозы аммиака, которая исчезала в ходе процесса в минимальное время — пять или шесть дней.

Наконец, возражения может встретить то обстоятельство, что для отдельных ступеней в качестве буферов применялись различные основания. Но так как элементы минерального питания — кальций, магний, натрий — во всех ступенях находились в избытке, то действие нерастворимых оснований и прибавленных следов углекислого натрия сказывалось только на изменении рН. Мы увидим, что роль рН, как фактора, влияющего на активность отдельных рас бактерий, ясно проявляется во всех опытах.

По нашему мнению, преимущество, которое представляет наша постановка опыта, заключается в том, что все ступени, не исключая и ступеней ниже рН 7,0, содержат карбонатные основания. Драгоценной является в этом отношении способность мрамора чрезвычайно медленно растворяться, оказывая слабое буферное действие, благодаря чему раствор сохраняет почти без изменений тот же рН ниже 6,0 в течение многих дней. Нам кажется, что таким образом мы приближаемся к условиям, свойственным кислой почве, т. е. к кислым почвенным растворам, содержащим крупинки или осколки извести, трудно растворимые, как и мрамор, из-за своих физических свойств.

Для засева серии колб переносим одну или несколько колоний с геля в 10 мл кипяченой воды и распределяем взвесь по 1 мл на колбу. Через два дня начинаем исследовать опытные колбы, применяя цветные реакции. Уже один этот опыт может дать примерное представление об оптимальном рН для данной расы. Привычка различать три степени реакции Троммсдорфа приобретается легко: бледноголубая дымка, знак +; синее пятно, знак 4- индигосинее пятно, знак + + -f. Для реакции Несслера — три снижающиеся степени; содержание аммиака: ржавое пятно XXX> желтое XX, бледножелтая дымка X. Результаты такого качественного опыта с Nitrosomonas, раса е (ниже мы даем ее описание и приводим ее свойства)

Количественное определение в конце опыта, разумеется, необходимо. Определяя в одинаковые для всей серии сроки образовавшиеся нитриты и следя за тем, чтобы ни одна опытная колба в течение этого времени не оставалась без аммиака, мы избегаем ошибки, которая могла бы произойти от самопроизвольной потери аммиака.

Очень простой графический рисунок отражает указанные опыты. На оси абсцисс нанесены дни, на ординатах отложены количества нитритов, образовавшихся к концу опыта в различных культурах серии, обозначенных соответственно их рН.

Удобнее принимать за 100 максимальную продуктивность данной расы при оптимальном для нее рН, и выражать в процентах продуктивность, соответствующую менее благоприятным рН. Мы и будем в дальнейшем придерживаться такого способа при характеристике рас в этом отношении.

При окислении в нитраты мы принимаем за 100 активность, являющуюся функцией рН, которая приводит к исчезновению определенного количества азота нитритов через определенный промежуток времени, одинаковый для всей серии. Определение азота нитритов в других колбах серии покажет, сколько его в них остается, и по полученным цифровым данным можно будет установить процентные отношения, как и в случае с нитрозобактериями.

Результаты получаются совершенно одинаково точные как для слабых, так и для более высоких количеств нитритов, но в последнем случае мы выигрываем много времени. Поэтому в каждую колбу следует вносить не больше 1 мг азота нитритов

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ