НИТРИФИКАЦИЯ

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

КУЛЬТУРА НИТРИТНОГО МИКРОБА НА ПЛОТНОЙ СРЕДЕ

Существует несколько способов приготовления плотной минеральной среды. Мы рекомендуем следующий метод, подробно разработанный Омелянским.

Для приготовления гидрозоля кремневой кислоты к соляной кислоте (удельный вес 1,1) приливают равный объем жидкого стекла (удельный вес 1,05—1,06); полученная смесь диализуется в мешочках из пергамента, непроницаемость которых предварительно тщательно проверяется. Рекомендуется работать с небольшими количествами смеси, диализуемыми 24 часа н проточной и такое же время в дистиллированной, часто сменяемой воде. Диализ ведут до тех пор, пока диализат не перестанет давать муть с раствором азотнокислого серебра. Полученный гидрозоль хранят в тщательно вымытых склянках с притертой пробкой. Гидрозоль, полученный таким путем, содержит около 2% кремневой кислоты и хорошо переносит стерилизацию при 120\ Он может быть использован в течение трех месяцев со дня получения.

Для приготовления пластинок употребляют следующие растворы:

1.         Сернокислого аммония 3 г; фосфорнокислого калия 1,0 г; сернокислого магния 0,5 г; дистиллированной воды 100 мл.

2.         2%-ный раствор сернокислой закиси железа.

3.         Насыщенный раствор поваренной соли.

4.         Тонкая взвесь углекислого магния в воде.

К 50 мл гидрозоля добавляется 2,5 мл первого раствора, 1 мл второго и несколько капель четвертого так, чтобы смесь приняла молочный вид. Смесь разливается quantum satis по маленьким чашкам Петри (диаметром не свыше 5 см) и в центр каждой чашки вносится платиновым ушком очень маленькая капелька насыщенного раствора поваренной соли. Для заражения геля в смесь гидрозоля и солевого раствора вводят каплю культуры, изобилующей монадами (следует избегать зооглеи, не распадающихся при перемешивании жидкости), после чего смесь взбалтывают при помощи палочки и разливают по чашкам Петри. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности до затвердения геля, которое происходит примерно через час. При посеве штрихом не следует забывать, что кремнекислый гель дает трещины значительно легче, чем органические студни. На поверхность застывшего геля наносят каплю жидкой культуры и осторожно распределяют по всей площади стеклянной палочкой с загнутым концом.

При работе с этими пластинками необходимо учитывать их отрицательное свойство — иногда после застывания выделять воду. Поэтому их следует держать в перевернутом положении и оттягивать воду, стекающую н крышку, стерильной фильтровальной бумагой.

Бесполезно изучать пластинки, прежде чем они покажут положительную нитритную реакцию. Для ее определения из пластинки вырезают кусочек геля, величиной и пшеничное зерно, и переносят в маленькую пробирку с реактивом Троммсдорфа пли с раствором дифениламина и серной кислоте.

Через 10 дней появляются колонии, видимые лишь при увеличений в 100 раз. Погруженные в толщу геля, они имеют вид сильно преломляющих свет телец с черными контурами неправильной формы. С возрастом они приобретают темную окраску. Эти «темные колонии» (табл. X, фиг. 4) столь плотны, что при прикосновении к ним нитевидного кончика стеклянного капилляра они погружаются в гель, не деформируясь. Однако по прошествии 15 дней вид их часто меняется: края утолщаются и покрываются светлыми наростами. Плотная «темная колония» превращается в «светлую» (табл. X, фиг. 3). Светлые колонии удается зацепить кончиком нитевидного капилляра и перенести для изучения в висячую каплю иЛи же приготовить фиксированные препараты. При изучении иод микроскопом эти колонии оказываются состоящими из овальных, часто подвижных клеток, сходных с теми, которые мы наблюдали в жидкой культуре.

Так как колонии обычно очень мелки, то отвивки из них сопряжены с большими трудностями. Мы рекомендуем следующий прием: с двух диаметрально противоположных концов пластинки вырезаются сегменты геля; в образовавшиеся выемки наливается по 1—2 капли раствора сернокислого аммония. «Подкормленные» таким образом колонии лучше видны, что облегчает манипулирование с ними. Необходимо производить боль шое количество отвивок, так как они зачастую оказываются неудачными. Обычно одновременно заражают много маленьких конических [колбочек. Посев производят так: кончиком нитевидного капилляра касаются с в е т- л ой колонии, а затем обламывают его о дно сосуда.

Для испытания чистоты культуры заражают щелочной мясной бульон несколькими каплями среды, в которой закончилось окр[Слепие нитритов. Зараженные пробирки выдерживаются в термостате не менее 10 дней. Если по истечении этого срока бульон останется неизменным, культуру можно считать чистой. В большинстве случаев этот контроль оказывается надежным, но все же не следует ему слепо доверяться.

Для культивирования микроба можно пользоваться еще двумя плотными средами: 1) агар-агаром, приготовленным по Бейеринку, и 2) маг- незиально-гипсовыми пластинками Омелянского.

Для приготовления первой среды агар-агар растворяют в горячей воде, выливают в кристаллизатор, охлаждают, заливают водой и оставляют на несколько недель в термостате. За это время проходит частичное разложение агар-агара. По прошествии нескольких недель агар извлекают из термостата, отмывают, добавляют 0,2 % двойной фосфорнокислой соли аммония- магния, 0,005% хлористого калия и мела. На этой среде нитритный микроб развивается медленно, и приходится ждать от трех недель до одного месяца, прежде чем обнаруживаются первые признаки его развития. •

Напротив, магнезиально-гипсовые пластинки Омелянского дают хорошие результаты. Готовят их следующим образом: смесь мелко измельченного гипса с 1 °/0 порошкообразного углекислого магния замешивают на воде до образования густой кашицы, которую выливают в квадратную формочку из полированного стекла. Когда масса начнет затвердевать, из нее вырезают кружки, диаметром в 5 см для культуры в чашках Петри или полоски для культуры в пробирках. Гипсовые пластинки помещают в соответствующие сосуды зеркально-гладкой стороной кверху, стерилизуют при 120°, наливают в эти сосуды раствор для культуры нитрифицирующих организмов так, чтобы он доходил до половины высоты гипсовой пластинки или до половины длины полоски в пробирке, и подливают раствор по мере необходимости. Для заражения пластинки размазывают штрихами по ее поверхности капельку культуры.

Испытание нитритной реакции производят обычным способом. После исчезновения аммиака удаляют использованный раствор и заменяют его свежим. К моменту появления сильной нитритной реакции колонии становятся видимыми в форме маленьких желтоватых точек. Более старые колонии принимают вид небольших бородавок довольно плотного строения. Позднее вокруг них появляется более или менее широкий валик светлой окраски. Таким образом и на данной среде мы обнаруживаем те же стадии развития, что на описанных ранее жидких и плотных средах.

Гипс может быть заменен фильтровальной бумагой, сшитой или связанной в плотные пачки. Из нее можно приготовить пластинки или употреблять в форме полосок для культуры в пробирках, до половины заполненных аммонийным раствором.

Морфологическая характеристика нитритных микробов различного происхождения

Было изучено некоторое количество штаммов, выделенных из образцов европейских и экзотических почв (см. статьи V и VIII). Одни из них подвергались лишь поверхностному изучению, позволившему тем не менее отметить их отличительные признаки; другие были выделены в чистом виде и культивировались достаточно долго, вследствие чего были охарактеризованы более полно. Но, разумеется, в данной области осталось еще много неисследованного.

Как уже было сказано выше, две формы, выделенные из почв Швейцарии и Франции (поля орошения в Женнвилье), казались идентичными. Последний штамм отличался особой активностью; культуры его всегда изобиловали монадами (табл. IX, фиг. 1 и 2).

Штамм, выделенный из петербургской почвы (табл. X, фиг. 2), значительно отличался от западного; он был представлен настоящими кокками, диаметром приблизительно в 1 [х, образовывал довольно плотные зооглеи, встречался также и в виде свободных форм, однако подвижные стадии отмечены не были.

Из образца почвы, взятой под Казанью (Россия), нами был выделен организм (табл. XI, фиг. 3), культуру которого удалось поддерживать в течение года. Она содержала овального микроба, сходного с французским, однако значительно меньших размеров, достигавшего лишь двух третей западной формы. Размеры микроба, выделенного из казанской почвы, не изменялись в течение всего длительного периода его культуры.

Что же касается экзотических образцов, то в почве Быотенцорга (Ява) нами был найден весьма своеобразный организм — крошечный кокк, не более 0,5—0,6 (л в диаметре, развивавшийся в форме монад и з о о г- л с й (табл. X, фиг: 1; табл. XI, фиг. 1 и 2). Последние оказались столь плотными, что с трудом можно было различить составляющие их кокки. Свободные клетки встречались исключительно в подвижном состоянии; часто удавалось заметить подвижные группы из 3-4 соединенных вместе клеток. Свободные организмы, а также входящие в состав упомянутых групп, несут один чрезвычайно длинный жгутик, достигающий 30 р. (табл. XI, фиг. 1). Несмотря на это, движение их медленно, неуверенно и несколько напоминает полет бабочек. На пластинках кремнекислого геля ()нц также образуют «темные колонии», превращающиеся в «светлые», окруженные по периферии различными выростами.

13 образце почвы из Токио этой формы не обнаружено. Нитрнтпый организм из этой почвы скорее приближался к европейскому виду, отличаясь от него лишь меньшими размерами. Неоднократно отмечался рост н ни до зооглеи, но свободные подвижные стадии, повидимому, отсутствовали.

В четырех образцах североафриканской почвы был найден штамм, сходный своей овальной формой с типом Цюрих-Женнвильс, но меньшей величины. Единственной наблюдавшейся формой роста оказались зооглеи, так как монады отсутствовали полностью.

Из североамериканского образца, прибывшего из Квито (Эквадор), удалось выделить вид, отличающийся по своей морфологии от всех ранее описанных нами. Это были настоящие кокки, довольно крупные (от J ,5 до 1,7 р. в диаметре), встречавшиеся всегда в свободном состоянии. Возможно, что в цикл их развития входили и кратковременные подвижные стадии, однако при наблюдении они не были отмечены. На кремнекислом геле этот вид образует относительно крупные колонии, похожие на капли светло- желтой жидкости.

В образце почвы из Кампинаса (Бразилия) мы обнаружили такого же кокка, как в почве Квито, только значительно более крупного (диаметром в 2 ц).

Наконец кокк, выделенный из почвы Мельбурна (Австралия), бесспорно относится к той же группе нитритных микробов Нового Света, отличаясь от двух предыдущих организмов лишь меньшими размерами.

Из сделанного нами краткого обзора видно, что изучение нитрифицирующих организмов находится еще в начальной стадии. В частности, мы еще ничего не знаем о причинах, влияющих на распределение различных форм в естественных субстратах. Имеем ли мы дело с местными разновидностями, приспособившимися к условиям обитания, или же с устойчивыми формами, обладающими врожденными специфическими признаками? Первое предположение, видимо, опровергается нашими опытами по длительному культивированию (от одного месяца до одного года и выше); второе нам кажется более вероятным.

В общем мы имеем мало сведений о распределении нитрифицирующих организмов в естественных условиях их обитания — в пахотных, лесных и невозделанных почвах, а еще меньше в водах. Мы не знаем, присутствуют ли эти организмы в морских водах или просторы морей являются непреодолимым препятствием на пути распространения этих микробов.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ