АЗОТОБАКТЕР

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

НАЧАЛО ИССЛЕДОВАНИЙ И МЕТОДИКА

Таково было в общих чертах состояние проблемы, касающейся механизма усвоения атмосферного азота, когда одно неожиданное наблюдение, о котором мы сейчас будем говорить, натолкнуло нас на мысль заняться разрешением этого вопроса.

Во всяком случае мы исходили не из работы Костычева и его сотрудников. Их методика не только не совпадала с теми принципиальными установками, на которые опиралась наша (об этой методике мы уже неоднократно говорили), но применение ее приводило к обнаружению фактов, никогда нами не наблюдавшихся в наших многочисленных культурах азотобактера. Напомним, что последние выращивались нами на пластинках из кремнекислого геля, пропитанных маннитом и зараженных небольшой навеской почвы.

Мы тщательно просмотрели и подвергли химическому анализу значительное число таких пластинок. Рост на них был обильный,—толстый слой слизи покрывал всю поверхность геля. Поэтому, если выделение аммиака происходит регулярно и если, как указывается в работе Костычева, оно энергичнее идет в молодых культурах, то тем более этот аммиак должен был бы появиться в условиях наших культур, в этом смысле более благоприятных. В наших опытах зародыши азотобактера попадали на пластинки из кремнекислого геля сразу из почвы, и выраставшая микробная масса свободно соприкасалась с воздухом, а не была погружена в значительный объем жидкой питательной среды. Но в течение двух лет, посвященных исследованию азотфиксирующей способности почв, ни одно из проведенных нами наблюдений не подтвердило выводов Костычева. Таким образом, казалось установленным, что обильные культуры азотобактера, развивающиеся за счет маннита, не выделяют синтезированного аммиака, как бы ни хотелось считать его первичным продуктом.

Совершенно очевидно, что этот отрицательный вывод нисколько не противоречит высказанной выше гипотезе о синтезе аммиака азотобактером, так как эта гипотеза не предусматривает обязательного выделения аммиака в окружающую среду. Напротив, было бы последовательнее думать, что этот аммиак утилизируется по мере своего образования молодыми, энергично растущими клетками микроба, и тем полнее, чем активнее культуры.

Не занимаясь специально выяснением условий выделения аммиака, мы все же очень быстро натолкнулись на факты, имеющие к этому отношение, проводя опыты с выращиванием культур азотобактера на различных питательных веществах. Вместо маннита на этот раз были взяты органические кислоты в виде солей натрия.

3 февраля 1930 г. была приготовлена пластинка из .кремнекислого геля, пропитанная следующим раствором, не содержащим азота:

Молочнокислого натрия, г 0,3

Раствора минеральных солей, мл  2,0

Углекислого кальция, г       0,3

2%-ного раствора поташа в количествах, необходимых для получения величины рН =6,9 Дистиллированной воды — сколько требуется

Заражение производилось 0,2 г почвы, взятой из-под шпалерных посадок (Ш.).

5 февраля пластинка была покрыта колониями азотобактера. От нее ясно пахло аммиаком; маленький кусочек розовой лакмусовой бумаги, укрепленный на крышке чашки Петри, быстро посинел.

Напрашивалось объяснение, что этот аммиак мог быть лишь продуктом азотфиксирующей деятельности азотобактера, так как питательная среда совершенно не содержала связанного азота, а клетки микроба были слишком молоды, чтобы подвергнуться автолизу.

Весьма вероятно, что вследствие щелочной реакции, получающейся в среде в результате разрушения кислотных ионов молочнокислого натрия, аммиак, образованный азотобактером, вытеснялся и не усваивался микробом.

Действительно, испытания, проведенные при помощи упрощенной, методики, указанной в нашем девятом сообщении (часть восьмая), показали, что небольшой свободный от слизи азотобактера кусочек геля брошенный в несколько капель тимолсульфофталеина, образует в нем синее пятно цвета индиго; это означает, что рН геля не ниже чем 8,8     

9,0. Таким образом, за 48 часов концентрация ОН-ионов возросла от первоначальной величины рН = 6,9 до величины рН = 9,0. Это быстрое повышение щелочности среды, очевидно, нарушило процесс усвоения в клетках азотобактера и позволило первичному продукту азотфиксации — аммиаку — выделиться в воздух.

Чтобы проверить это объяснение, молочнокислый натрий был заменен янтар но кислым.

Была приготовлена пластинка из кремнекислого геля, в точности сходная с предыдущей, за исключением того, что в нее было внесено 0,3 г янтарнокислого натрия вместо такого же количества молочнокислого; рН = 7,0; заражение было произведено 0,2 г почвы из-под шпалерных посадок (Ш.). Через 48 часов ощущался легкий, но явный запах аммиака; наблюдалось посинение лакмусовой бумажки и другие признаки, указывающие на выделение аммиака в воздух и на его присутствие в геле.

Таким образом, мы имели дело с вполне определенным фактом выделения аммиака. Противоположный факт был нам известен еще раньше, когда при культивировании азотобактера на манните выделение аммиака не наблюдалось. Отсюда вытекало заключение, что выделение аммиака зависит от условий культивирования азотобактера и, в частности, от предложенного микробу энергетического вещества. Поэтому было важно ближе исследовать с интересующей нас точки зрения некоторые из этих веществ, выбранные в качестве типичных. Чтобы выполнить эту задачуу мы провели несколько опытов, которые будут в дальнейшем описаны с распределением их по группам в зависимости от природы питательных веществ.

Что касается методики, то мы пользовались чашками Петри то диаметром 10 см,то большими, диаметром 20 см, наполненными кремнекислым гелем, пропитанным раствором того или иного состава. В некоторых опытах употреблялись пластинки из агара. Делая посев, мы рассыпали по пластинке частицы почвы, взятой из образца, богатого зародышами азотобактера, что, согласно нашим воззрениям, высказанным в начале этой статьи, было наилучшим способом заражения.

Однако мы пользовались для заражения и чистыми культурами микроба. Быстрее всего непосредственно из почвы удавалось выделить чистые культуры азотобактера, применяя 9—10-сантиметровые пластинки из кремнекислого геля с бензойнокислым натрием. Применялся следующий раствор:

Бензойнокислого натрия, г              0,1

Раствора солей, мл   2,0

Углекислого кальция, г       0,1

2%-ного раствора поташа 3 капли или количество, необходимое для установления рН = 7,0.

Производили посев, рассыпая — лучше всего при помощи тигля Гуча — 0,01—0,02 г почвы, достаточно богатой азотобактером, т. е. дающей по крайней мере 2000 колоний из одного грамма. Через 2г/2 дня при температуре 30—32° характерные колонии, уже окруженные темным орео- ij0My проникающим в толщу геля, достигали в диаметре от нескольких миллиметров до 1 см. Чаще всего никаких посторонних колоний под микроскопом не обнаруживалось. Обычно преобладал азотобактер с крупными клетками. Взяв несколько петель из выбранной колонии, делали взвесь в 10 мл стерилизованной водопроводной воды и наносили на большую чашку Петри 2 мл и на малую 0,25 мл этой взвеси, с расчетом, чтобы смочить всю поверхность пластинки кремнекислого геля. По прошествии 24 часов она вся покрывалась слоем слизи азотобактера.

Для этих же целей можно было воспользоваться пластинками, пропитанными этиловым спиртом, согласно рецепту, приведенному дальше. Развитие на них шло быстрее, но при тщательном просмотре здесь можно было встретить редкие скопления маленьких палочек, расположенных радиально (Radiobacter?), которые, однако, ввиду их малочисленности, не могли влиять на опыты.

Для того чтобы без потерь улавливать аммиак, выделяемый культурами, нужно было бы выращивать их в закрытых колбах, соединенных с приспособлениями для очистки воздуха и с промывными склянками, что усложнило бы опыты и повело бы к сокращению их числа. Между тем, как это будет видно из дальнейшего, количество выделяемого аммиака варьирует в слишком широких пределах, для того чтобы можно было установить количественные соотношения. Поэтому целесообразнее, по возможности, умножать качественные определения в целях накопления наибольшего числа наблюдений, иногда может быть и отрицательвы!х, над выделением аммиака, временем его появления, продолжительностью и ритмом процесса. Чтобы заметить начало выделения аммиака, наклеивают при помощи капельки расплавленного агара небольшой кусочек розовой лакмусовой бумаги на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри, а чтобы следить за дальнейшим развитием процесса и приблизительно учесть количество выделяемого аммиака, проще всего испытывать реактивом Несслера конденсационную воду, собирающуюся на крышках чашек Петри. Если конденсации нет, ее можно вызвать, помещая на чашку Петри, находящуюся в термостате при температуре 35°, большую плоскодонную коническую колбу, диаметром в 20 см, наполненную холодной водой, которая служит как бы холодильником. Через четверть часа после этого удаляют капельки, покрывающие всю внутреннюю поверхность крышки, при помощи небольшого количества воды, свободной от аммиака, сливают в специальную пробирку, ополаскивают крышку два или три раза, доливают пробирку до метки и прибавляют по каплям 2 мл реактива Несслера.

Эта методика позволяет наблюдать за выделением аммиака неопределенно долгое время, не повреждая культуры.

Если же не хотят следить за ходом выделения аммиака, а желают лишь убедиться в том, что оно действительно происходит в количествах, достаточных для определения, то ставят под опрокинутую крышкой вниз 20 -сантиметровую чашку Петри небольшое плоское блюдечко с 7V/1 серной кислотой. Через 8 дней сливают кислоту в колбу, прибавляют соды и перегоняют, собирая отгон в N/10 кислоту, которую титруют.

Для обнаружения аммиака в геле в любой момент, не повреждая культуры, достаточно вырезать из него маленький, не покрытый слизью кусочек, величиной с пшеничное зерно, и бросить его в каплю реактива Несслера. Даже при внесении очень незначительных количеств аммиака, менее 1 мг на большую чашку Петри, кусочки через несколько минут принимают желтую, а при больших количествах — ржавую окраску. Последнее уже указывает на то, что пластинка кремнекислого геля даст при перегонке несколько миллиграммов аммиачного азота.

В дальнейшем количества аммиачного азота определенные при помощи реактива Несслера, будут даваться в сотых долях миллиграмма.

ВЫВОДЫ

Количественные опыты, описанные в настоящей работе, кажутся нам достаточно многочисленньши и совпадающими один с другим, для того чтобы можно было сделать следующие заключения:

1.         Молодые культуры азотобактера на питательных средах, лишенных связанного азота, на ранних стадиях развития образуют аммиак, который обнаруживается в клетках микроба и выделяется также в воздух.

2.         Выделение свободного аммиака начинается раньше и происходит энергичнее при величине рН, приближающейся к 9,0.            ^ ^

3.         Выделение аммиака клетками происходит в незначительных^коли- чествах, но продолжается длительное время. Начавшись в молодых культурах, это выделение достигает наибольшей величины при старении клеток и их автолизе.

4.         Продуктивность зависит от условий культивирования, а именно от того, какой источник углерода внесен в качестве питательного материала. При наличии Сахаров (глюкоза) и маннита выделение незначительно или не происходит вовсе.

5.         Весьма вероятно, что аммиак, выделяемый молодыми клетками азотобактера, не является продуктом автолиза, а представляет собой продукт синтеза молекулярного азота. Эта проблема, само собою разумеется, могла бы быть окончательно разрешена только количественным методом, который дал бы возможность установить, что начальный запас азота в клетках микроба не уменьшается в результате образования аммиака, или же, если и уменьшается, то потеря меньше, чем количество образующегося аммиака.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ