О РАЗРУШЕНИИ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ В ПОЧВЕ

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

МЕТОДИКА

В этом разделе будет описана методика, применяемая ко всем группам: 1) элективная среда и вспомогательные среды; 2) самопроизвольные культуры, 3) разделение и определение штаммов, 4) методы окраски и морфологические исследования, 5) химические методы.

Несмотря на простоту приемов, необходима точность в обращении с этими специфическими организмами.

Элективная среда. Единственная среда, которой мы пользуемся для пересевов,— кремнекислый гель в чашках Петри, диаметром 10—20 см, пропитанный минеральными солями, покрытый целлюлозным материалом.

О способе приготовления геля, описанном в другом месте, можно не упоминать; добавим только, что желательно избегать «улучшений», вносимых в нашу методику, особенно таких, которые имеют в виду ускорить коагуляцию или обойтись без длительного промывания. Долгий опыт показал, что наиболее верный способ получить устойчивый гель, пригодный для продолжительного применения, это именно длительное застывание (24 часа и дольше) в присутствии избытка кислоты и последующее длительное промывание в холодной воде и затем в теплой.

Что же касается раствора, которым гель должен быть пропитан, чтобы стать питательной средой, то здесь надо иметь в виду два момента: 1) его реакцию, 2) азот, необходимый для культуры.

Уже Гэтчинсон и Клэйтон указывали, что зона кислотности, в которой может развиваться Cytophaga, обширна. Развитие идет и в кислой и в щелочной среде в пределах, по их данным, от НС1 7V/50, с одной стороны, до NaOH N/55, с другой. Действительно, Cytophaga и вибрионы могут давать рост на кислой среде. Но нам никогда не удавалось поддерживать культуру при рН ниже 7,0. Рано или поздно замечалось вырождение и пересевы переставали давать развитие. Наоборот, при поддержании рН 7,2 и выше пересевы удаются неограниченное время.

З

аметим, что начальное рН изменяется в культуре в основном за счет ассимиляции азота: рН геля повышается, когда азот дан в виде нитрата; он падает при использовании сульфата аммония.

Что касается целлюлозы, то мы с давних пор остановились на фильтровальной бумаге. Ее употребление является основным в применяемой нами методике. Бактерии этой группы ее энергично потребляют, образуя пятна различной окраски, которые и являются колониями. Именно характер роста, цвет, манера распространяться по бумаге и изменять ее и составляют те макроскопические признаки, которые вместе с микроскопическими свойствами позволяют различать виды и штаммы.

Наибольшие преимущества представляет употребление целой бумаги, а не измельченной, или в виде массы, и еще лучше в виде готовых фильтров, придерживаясь определенной марки, тонкой, мелкозернистой, белой, а не кремовой. Мы пользовались фильтрами Durieux № 111, белыми, преимущественно 70, 90 и 150 мм в диаметре. Их вес мало колеблется, составляя в среднем 0,24, 0,45 и 1,20 г. Влажность бумаги в обычных лабораторных условиях почти не меняется и составляет всего около 7%. Ее всегда можно без заметной ошибки приравнивать к этой величине, что избавляет от определения влажности.

Необходимую для морфологических наблюдений фильтровальную бумагу выгодно заменить хлопчатобумажной тканью (перкаль, нансук, батист и т. д., конечно, освобожденные от аппретуры), когда речь идет о химических исследованиях. Преимущество этих тканей состоит уже в том, что они лишены оксицеллюлозы, в то время как фильтровальная бумага ее всегда содержит, особенно лучшие марки. Другое преимущество хлопчатобумажных тканей в том, что после воздействия бактерий эти ткани легко снять с поверхности геля и при желании заменить новыми, причем воздействие бактерий все более и более ускоряется. В этом случае мы пользуемся чашкой с гелем, диаметром в 20 см, на которую помещают 20—25 маленьких квадратиков ткани со стороной в 2—3 см, что составляет в среднем 1,5 г.

Можно ли применять целлюлозу в тонко размельченном состоянии? Можно, но только не осажденную, как рекомендует Келлерман, а гидроцеллюлозу Жирара, в которой лишь минимальная часть целлюлозы изменена химически и по молекулярной структуре.

Для приготовления гидроцеллюлозы погружают вату в 3 %-ную серную кислоту, отжимают до такой степени, чтобы масса содержала жидкости не более 35—40% своего веса, высушивают, потом оставляют на несколько часов при 40° или на 4 часа при 70°. Быстрее ее можно приготовить следующим образом: алонж, набитый ватой, укрепляют при помощи пробки с отверстием над колбой с небольшим количеством концентрированной соляной кислоты. Колбу слегка нагревают до тех пор, пока пары не начнут выходить из алонжа. Тогда нагревание прекращают и оставляют алонж над колбой в течение часа. Затем вынимают вату и тщательно отмывают. Вата, обработанная таким образом, сохраняется целой, но легко крошится. Растертая с водой в ступке она образует совершенно однородное «молоко», очень медленно оседающее, которое представляет собой тонкую суспензию обломков волокон, как в этом можно убедиться при микроскопическом исследовании.

Этой суспензией можно покрыть кремнекислый гель или приготовить с ней агар по типу Келлермана. Ниже будет дан рецепт. Эта бактериологическая среда, белизной и блеском напоминающая фарфор, очень изящная на вид, не оправдала тех надежд, которые на нее были возложены. Некоторые виды, которые мы опишем, не росли на ней. Другие давали желтые пятна, но не образовывали хорошо дифференцированных колоний и не Давали так называемых энзиматических зон.

Чтобы закончить с целлюлозными средами, приведем рецепты и детали приготовления.

Готовят в запас концентрированный раствор минеральных солей, содержащих а 200 мл дистиллированной воды, в граммах:

Монофосфат калия              1,0

Сульфат магния                   0,5

Хлористый натрий               0,5

Сульфат железа        0,01

Сульфат марганца    0,01

Азот в форме нитрата калия, чистый и сухой, в виде пудры, рассыпают прямо на гель, где соль немедленно исчезает.

Для пластинки, диаметром 10 см, приготовленной из 30 мл смеси силиката и кислоты в равных объемах, берут около 5 мг азота, т. е. 36 мг KN03. В маленькой склянке Фурно, вместимостью 50—60 мл, смешивают:

Вышеуказанный солевой раствор, мл       2

Карбонат кальция, г 0,02

Дистиллированная вода, мл           10

Поташ в Риде 3%-ного раствора: 4 капли или количество, необходимое для установления рН около 7,2.

Таких склянок берут столько, сколько хотят приготовить пластинок. Их можно поставить в количестве до полудюжины на асбестовый круг и прокипятить все сразу в течение 5 минут. Кипящую жидкость выливают на чашки и ставят, последние без крышек в термостат Ру до испарения излишней жидкости.

Кружки фильтровальной бумаги стерилизуются в автоклаве и выдерживаются до употребления в термостате. Их берут фламбированным пинцетом и кладут на поверхность геля. Если чашки высушены достаточно, то фильтр не намокает, пока его не прижмут к гелю фламбированным фарфоровым шпателем. Это верный признак полного удаления избытка влаги, что является необходимым условием успешного выделения.

Для больших чашек берут, в граммах:

Нитрат калия            0,2

Карбонат кальция                0,1

Солевой раствор, мл                        10

Дистиллированная вода, мл                       30

Поташ 2%-ный раствор 20 капель или количество, необходимое для установления указанного рН.

На поверхность помещают фильтр в 150 мл в диаметре.

Когда необходимо сделать большое количество пересевов, работу можно облегчить, раскладывая бумагу в виде секторов на расстоянии один от другого, как это можно видеть на 48. Если гель и бумага хорошо освобождены от излишней влаги, микробы не способны преодолевать расстояние между секторами и каждая чашка может служить для четырех пересевов, заменяя таким образом четыре чашки, покрытые сплошным кружком каждая.

Если хотят использовать хлопчатобумажную ткань вместо бумаги, берут большую чашку и кладут на нее маленькие квадратики ткани. Их кипятят некоторое время в пробирках, затем вынимают, прижимая их к горячим стенкам пробирки, чтобы стекла лишняя вода, но не высушивают.

Что касается гидроцеллюлозы, то прежде чем употреблять ее для среды, следует помнить, что измененные волокна целлюлозы трудно отмыть от кислоты. Сначала надо промывать их на бухнеровской воронке 1%-ной содой, а потом теплой водой до исчезновения щелочной реакции. Хорошо отжатую массу растирают порциями в большой ступке массивным пестиком в растворе следующего состава:

Нитрат калия, г                    0,2

Карбонат кальция, г             0,1

Солевой раствор, мл                        10

Дистиллированная вода, мл                       100

Поташ 2%-ный до установления рН-7,2.

На этот объем можно взять до 5 г гидроцеллюлозы. Из этого получается достаточно густое «молоко», к которому добавляют 2 г агара.

Реакцию надо проверить еще раз после добавления агара.

Что касается агаровых питательных сред без целлюлозы, то можно ограничиться следующими пятью рецептами:

1.         Пептонный агар (среда Т):

Пептон, г                   4

Глюкоза, г                 0,2

Хлористый натрий, г                       0,5

Дистиллированная вода, мл                       100

Агар, г                        2

Подщелочить до розового окрашивания фенолфталеина.

2.         Крахмальный агар. 10 г крахмала кипятят в солевом растворе следующего состава на 1 л:

Сернокислый аммоний, г               1,5

Фосфат калия, г                    1,0

Сульфат магния, г                0,5

Хлористый натрий, г                       0,5

Карбонат кальция, г             1,0

Дистиллированная вода, мл           1000

Добавляют 20 г агара и устанавливают реакцию, соответствующую ясно синей окраске бромтимолсинего.

3.         Глюкозный агар: 10 г глюкозы, остальное — как выше описано.

4.         Гуммиарабик агар: 10 г адрагантовой камеди в виде порошка, остальное — как выше описано.

5.         Минеральный агар без добавок.

Мы не употребляем жидких сред по следующим причинам:

1.         Всякое погружение в жидкость неблагоприятно для этих микроорганизмов, которые в исключительной степени чувствительны к доступу воздуха. Мы увидим, что даже толщина тоненького листка фильтровальной бумаги препятствует окислению волокон на стороне, обращенной к гелю. Этого факта достаточно, чтобы понять ошибку, которую допускают те, кто применяет жидкие среды для накопительных культур. Задача усложняется еще и тем, что вырастает более сложная смесь микробов (особенно в пептонной среде), тогда как гораздо легче найти активные виды прямо в почве, в более чистом состоянии.

2.         Развитие микроорганизмов происходит за счет нерастворимого тела, и не жидкость, а именно волокна являются их местообитанием. Микроскопический контроль культур показывает, до какой степени эффективнее пользоваться кружком, лежащим на поверхности твердой среды, чем кусочками бумаги, погруженными в жидкость.

3.         В жидких культурах нельзя заметить никаких признаков, которые могли бы помочь различать между собой виды и штаммы. Именно применению жидких сред можно приписать то обстоятельство, что под процессом «разрушения» до сих пор подразумевали процесс, в результате которого бумага делается дряблой и образуется бесформенная масса, не улавливая различий в воздействии разных штаммов.

Эти соображения достаточны для того, чтобы изъять из употребления в Данном случае жидкие среды и пользоваться только пластинками даже Для количественных опытов.

Самопроизвольные культуры

. Под термином самопроизвольные культуры  мы подразумеваем размножение микроба в той самой почве, которая его содержит, в результате добавления энергетического материала. Испытанный в настоящем случае этот метод встретил затруднения, которые препятствуют его постоянному применению. Они заключаются в том, что добавление Целлюлозы к почве вызывает развитие очень разнообразных мелких форм, чрезвычайно трудно распознаваемых, сопровождаемых, кроме того, развитием мицелия, который делает работу еще более затруднительной.

Гораздо лучше разредить, так сказать, частицы почвы, применив комочки, которые раскладываются на кружке фильтровальной бумаги на стандартной среде. При помощи тоненькой заостренной стеклянной палочки захватывают комочки почвы и раскладывают на бумаге на расстоянии 1—1,5 см. На кружке в 70 мм в диаметре можно разместить в среднем 25, на кружке в 90 мм, который покрывает почти всю поверхность геля, можно удвоить это количество. При выдерживании при 30°, часто уже через 48 часов вокруг комочков образуются окрашенные зоны.

Этот способ культивирования, столь простой, который изображен на рисунке в красках с натуры (табл. XXI, фиг. 14), служит для разных целей при исследовании разрушения целлюлозы в почве. Его нельзя заменить никаким другим методом, который позволил бы выделять специфических микробов из естественной среды с такой же быстротой и уверенностью. Макроскопически виды различаются характером разрушения волокон и особенно окраской, которую они сообщают фильтровальной бумаге.

На красочной таблице XXI художник воспроизвел более дюжины оттенков (фиг. 1—12,13, 15, 17), которые образуются в захваченных микробами зонах, и это еще не все.

Преобладают обычно оттенки бледножелтый, цвета охры, светлокорич- невый. Часто встречаются яркие цвета — розовый, оранжевый, яично- жёлтый, зеленые. Темнокоричневый и черные встречаются в возделываемой почве реже, и, кроме того, появляются медленно.

Разумеется, почти невозможно воспроизвести акварелью эти оттенки с полной точностью, в особенности такой характер штаммов, как матовые или блестящие, мутные или прозрачные. Более того, интенсивность окраски меняется с возрастом культуры таким образом, что очень молодая культура окрашена бледно и принимает окончательную окраску только при созревании. Тем не менее, образчики окраски будут полезны при описании штаммов, у которых окраска является диагностическим признаком.. Это плохо достигается словесным описанием.

Нередко организм, образующий зону, на первый взгляд кажется чистым, и посторонние формы обнаруживаются только после поисков. Об этом можно составить себе представление, если рассмотреть фотографии фиг. 2 (табл. XXII), фиг. 5 (табл. XXIII), фиг. 1—6 (табл. XXIV), на которых представлена микроскопическая картина самопроизвольных культур без всякого предварительного очищения. В некоторых случаях в зонах одного и того же внешнего вида можно найти смесь 2—3 форм. В общем группа штаммов определяется как бактериальная популяция, специфичная для данной почвы.

Имея дело с различными пробами почвы, можно убедиться, что на чашках появляются почти одни и те же биотипы, каково бы ни было происхождение пробы. Нельзя сказать, что все почвы образуют одинаковые пятна. Наоборот, часто, особенно из культурных почв, образуются исключительно желтые зоны цвета охры. Ясно, что преобладают те вибрионы, которые их образуют. Но нельзя сделать вывод, что все другие виды отсутствуют, так как появление с самого начала желтых вибрионов может предотвратить или замаскировать образование других различных зон. Этим можно объяснить то, что бедные почвы, не унавоженные и не окультуренные, дают более разнообразные зоны, чем удобренные почвы. Наша контрольная делянка, которая в течение многих лет не удобрялась и не засевалась, стала так бедна микробами этой группы, что самопроизвольные культуры из нее не вырастают в течение 5—7 дней при 30°, тогда как все чашки, засеянные другими образцами, прорастают. Эта делянка является для нас лучшим источником для выделения Cytophaga, развитие которой идет более медленно и которая не так активна, как вибрионы. Редкие зародыши, сохранившиеся жизнеспособными, могут развиться в самопроизвольной культуре без помехи со стороны вибрионов,, в состоянии естественной чистоты, которое необычайно способствует началу опытов (см. фотографии, упомянутые выше).

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ