Медицинская литература

Вирусы гриппа и грипп

Раздел: Медицина 

М. В. ЛОНС (М. W. PONS)

I. ВВЕДЕНИЕ

Вирус гриппа имеет уникальный по сравнению с другими вирусами животных спектр биологических свойств. Он обладает способностью .к множественной реактивации (Hoyle, Liu, 1951), образованию неполных вирусных частиц (von Magnus, 1954), чувствителен к антиномицину D (Barry et al., 1962), его нуклеиновая кислота неинфекционна -и он обладает способностью к генетической рекомбинации (Simpson, Hirst, 1961; Hirst, 1962). Это последнее свойство .позволило высказать предположение, что геном вируса гриппа состоит из двух или большего числа фрагментов однонитчатой рибонуклеиновой кислоты (РНК), а не из одной цепочки ковалентно связанных нуклеотидов (Burnet, 1956; Hirst, 1962). Впоследствии эта биологическая гипотеза была подтверждена биохимическим анализом РНК, изолированной из внр'ионов (Duesberg, 1968; Pons, Hirst, 1968а), л тем фактом, что внутриклеточная репликативная форма вирионной РНК также существует в виде отдельных фрагментов (Pons. Hirst, 1968).

Рибонуклеиновая кислота вируса гриппа составляет 0,8— 1,1% сухой массы вирусной частицы (Ada, Perry, 1954; Frisch-Niggemeyer, Hoyle, 1956; Frommhagen et al., 1959). Химический анализ РНК, изолированной из очищенных ви-рионов, позволил оценить массу РНК 2-Ю6—3-Ю6, содержащейся в одной вирусной частице (Ada, Perry, 1954; Frisch-Niggemeyer, Hoyle, 1956). Полученная величина, однако, является 'без сомнения слишком малой. Хотя она и достаточно близка к общепринятой величине 4,5- 10s—5-Ю6 РНК «а один вирион, слишком малое процентное содержание РНК в вирионе гриппа, .а также (или) присутствие в вирусной популяции неполных вирусов могут явиться причиной заниженной оценки количества РНК, входящей в состав одной вирусной частицы (см. раздел ШВ).

II. МЕТОДЫ

А. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ОЧИСТКА ВИРУСОВ ГРИППА

Существует несколько различных методов очистки вирусов гриппа. Описанный здесь метод постоянно используется в нашей лаборатории, а также, с небольшими модификациями, в некоторых других научных группах. Метод одинаково пригоден для очистш вируса, культивированного как на куриных эмбрионах, так ,и на монослойной культуре фибро-бластов куриного эмбриона (CEF). Кроме того, с помощью этого метода получают препараты вируса высокой степени чистоты с 40% выходом относительно исходного количества вирионов при очень небольшой .потере инфекционное™ и ге-магглютинирующей активности. В .настоящее время описаны и другие методы очистки (в 'частности, с использованием для осаждения сульфата аммония), с помощью которых также получают вирусные препараты высокой чистоты, однако высокая 'концентрация соли, используемая в этих методах, оказывает нежелательное действие на инфекционность вирионов. Необходимо отметить, что основное требование, предъявляемое к описанным здесь -методикам, состояло в минимальном воздействии на инфекционность вируса.

В большинстве биохимических работ, выполненных на вирусах гриппа США, в качестве объекта исследования использовали штамм WSN. В Европе же внимание сосредоточилось на изучении FPV, другого штамма вируса гриппа А. Различия между этими двумя штаммами (в частности, в нуклеиновых кислотах и их репликации), вероятно, не особенно велики.

Штамм WSN обычно 'Культивируется на первичной культуре фнбробластов куриных эмбрионов (CEF). Для получения больших количеств вируса [порядка 5-Ю10—10-Ю10 бляшкообразующих единиц (БОЕ)] 40—60 сплошных монослоев инокулируютея с вирусом с множественностью заражения приблизительно 5-Ю""5 БОЕ на клетку. Монослои инкубируют при 37 °С в течение 40 ч в атмосфере 5% СО2 (Simpson, Hirst, 1961), и вирус выделяют из сулернатанта по методике, описанной далее. Для получения радиоактивно меченного вируса в систему непосредственно перед инкубацией при 37 °С добавляют нужные изотопы, обычно [3Н]-5-уридин (2— 5 М'кК!и/мл) или [3Н]-или,[14С]-аминокислоты (2—4мкКи/мл).

После обработки РНК-азой вирус наслаивают поверх 4 мл 30% сахарозы в буфере STE и центрифугируют в течение 1 ч при 145 000 g. К осадку добавляют буфер STE, смесь гомогенизируют для того, чтобы полностью ресуслендировать вирус, и центрифугируют для удаления дебриса на малой скорости. Сулернатант наслаивают на линейный градиент сахарозы (по 10 мл 30—60% сахарозы в буфере STE), покрытый слоем минерального масла (10 мл) и центрифугируют до равновесия в течение 17 ч при 96 000 g. Видимый визуально слой вируса обнаруживают в области плотностей 1,18—1,19 г/см3 и отбирают по фракциям (1 мл), начиная со дна пробирки. Сахарозу удаляют из вирусной суспензии либо хроматографией через сефадекс Г-50, либо с помощью осаждения вируса центрифугированием в течение 60 мин при 145 000 g и ресуспендирования  осадка  в  буфере  STE.

Б. ЭКСТРАКЦИЯ ВИРИОННОЙ РНК

1. Экстракция РНК из вирионов

Вирус, очищенный по описанной методике и осажденный для удаления сахарозы, переводят в малый объем буфера STE (обычно 0,2—0,4 мл). После полного ресуспендирования осадка добавляют 1—2 мл буфера SLA (0,5% SDS, 0,14 М LiCl в 0,01 М ацетатного буфера, рН 4,9) и равный объем смеси свежеперегнанного водонасыщенного фенола с хлороформом (1 : 1). Смесь взбалтывают 'вручную в течение 4 мин, фазы разделяют центрифугированием на низкой скорости и верхний водный слой осторожно отсасывают без нарушения целостности интерфазы. После добавления двойного объема 95% этанола РНК выпадает в осадок в течение ночи яри температуре —20°С, осадок отделяют центрифугированием, растворяют в подходящем буфере и вторично осаждают спиртом. Если предполагается проводить анализ РНК с помощью

ПААГЭ, крайне важно, чтобы РНК после первого осаждения спиртом растворялась в электрофорез-ном буфере (5 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCl, 0,05% SDS, 5 мМ трис-HCl, рН 7,4). Если концентрация NaCl хотя бы немного превысит величину 10 мМ, это приведет к тому, что большое количество РНК останется в верхней части геля, а электрофореграмма 'будет низкого качества.

Из клетки могут .быть экстрагированы три типа вирусспе-цифичеоких РНК: 1) вирлонная РНК (вРНК); 2) РНК, комплементарная к вирионной (вкРНК); 3) двунитчатая РНК (днРНК). Относительно чистую вРНК удается изолировать из нукленново-белкового комплекса — рибонуклеопротеида (РНП). Метод выделения будет описан в разделе VA, 1 этой главы). Выделение вкРНК обычно происходит при выделении РНК из препарата полисом, поскольку основная часть, если

не вся  вирусная  информация   (мессенжер)   РНК   (мРНК), представляет собой вкРНК (раздел VB,1).

В нескольких работах 'была описана изоляция из инфицированных клеток вирусопецифической днРНК (Pons, 1976b;. Pons, Hirst, 1968b). Метод изоляции включает обработку инфицированных клеток смесью фенола с SDS с последующей хроматографией изолированной РНК на колонках с целлюлозой CFll (Franklin, 1966) и выделением продукта, на 90% состоящего из молекул, устойчивых ,к обработке РНК-азой. РНК, изолированные этими -методами, при изучении их с помощью ПААГЭ, давали шесть хорошо разрешенных фрагментов вирусспецифичехжой РНК (26). Денатурация днРНК с помощью диметилсульфоксида приводила «к возникновению однонитчатых РНК (онРНК) с электрофоретической подвижностью, эквивалентной таковой фрагментов вРНК (Pons, Horst, 1968b).

В. АНАЛИЗ ЭКСТРАГИРОВАННОЙ РНК

В настоящее время имеется много методов изоляции вирусной РНК из инфицированных клеток и вирионов. Выбор того или иного метода диктуется в большой степени методикой анализа продукта и тем, жак этот продукт будет использоваться. Это означает, что если необходимо изучить 'биологическую активность экстрагированной РНК, то в процессе выделения желательно присутствие малых количеств Mg2+. Однако наличие в системе Mg2+ приводит к агрегации РНК вируса гриппа и, если агрегаты не удалить (например, с помощью добавления ЭДТА) до анализа, можно получить ложные данные при исследовании образцов РНК с помощью метода скоростной седиментации. В большинстве случаев вирус-специфические РНК экстрагируют с помощью смеси фенол— хлороформ (1:1) в присутствии SDS (Penman, 1969) в буфере SLA.

1. Анализ экстрагированной РНК с помощью градиентного центрифугирования

Скоростное градиентное центрифугирование является простейшим методом определения седиментационных параметров и получения основной информации о вирионных и вирусспецифических РНК- Рибонуклеиновую кислоту, полученную из вирионов, обработанных смесью фенол—хлороформ SDS, ресуспендируют после осаждения спиртом в буфере STE. РНК наслаивают на линейный (10—35%) глицериновый градиент (объем единичного градиента 17 мл) в 'буфере STE, содержащем 1 М мочевину (STEU-буфер). Нами было обнаружено, что, если покрыть центрифужные пробир-

ки тонким слоем силиконовой смазки, это улучшает разрешение и уменьшает влияние стенок во время центрифугирования. Глицерин используют при проведении 'большинства опытов (исключая опыты по изучению полисом), поскольку он имеет более низкую плотность, чем сахароза; в отличие от сахарозы может быть подвергнут автоклавнрованию для стерилизации и разрушения примесных РНК-аз; не замерзает при температуре —20 "С, а это решает ряд проблем, возникающих при замораживании биологического материала, и, наконец, глицерин является более слабым, чем сахароза, гасителем в большинстве сцинтилляционных жидкостей.

После прохождения вирусной РНК через глицериновый градиент при центрифугировании при 120 000 g в течение 17 ч фракции (по 1 мл) собирают, начиная от дна центрифужной пробирки, и определяют радиоактивность каждой фракции. Как видно из 27, с помощью этой методики РНК можно разделить на три класса с седиментационными коэффициентами приблизительно 18S, 14S и 11S. Если препа-

рат вируса не обработать во время очистки РНК-азой, обычно дополнительно наблюдаются четыре класса с коэффициентами седиментации в пределах 4—7S. Вероятно, материал с коэффициентом седиментации 7S представляет собой хозяйские и свободные вирионные РНК, адсорбированные на поверхности вириона.

2. Анализ экстрагированной РНК с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГЭ)

Хотя анализ вирусной РНК с помощью ПААГЭ и является более сложным, чем ее исследование с помощью седиментации, он является более информативным методом. В основном до настоящего времени пользовались двумя системами гелей:   агарозо-акриламидным  с  использованием  в   качестве сополимеризатора бисакриламида  (Pons, Hirst, 1968a)  и ак-риламидным гелем без агарозы с использованием в качестве' вещества, образующего    поперечные   молекулярные сшивки, этилелдиакрилата (Duesberg, 1968). Обе системы имеют свои преимущества   и   недостатки,   однако  детально   мы  опишем только  первую систему.   Наш  опыт использования  системы агароза — акриламид — бисакриламид  позволяет утверждать, что для получения удовлетворительных результатов необходимо исключить несколько  источников  регулярных  ошибок. Детальное описание самого метода приведено в работах Pons и Hirst  (1968a), а также Pons   (1972).  К важным деталям эксперимента, о которых упоминалось ранее и которые были опущены в приведенных работах, относятся:  необходимость получения гелей и проведение электрофореза  в стеклянных трубках, покрытых силиконовым веществом, таким,  как ди-метилдихлорсилан; необходимость покрывать гель слоем воды сразу же после смешения компонентов геля до возникновения полимеризации и, наконец, нежелательность введения ■в раствор анализируемой РНК стартового красителя. Стартовый краситель должен помещаться в отдельный гель, приготовленный аналогично гелю с анализируемой РНК.

На 28 представлена типичная электрофореграмма РН1-уридин-меченой вРНК, изолированный из в'ирионов.. Гельэлектрофорез днРНК, полученных из инфицированных клеток, показал присутствие шести различных по длине мо-текул РНК (см. 26) (Pons, Hirst, 1968). По данным Skehel (1971), с помощью ПААГЭ можно получить шесть различных молекул онРНК, если разрушать вирус с помощью' додецилсульфата лития. С другой стороны, Lewandowski и соавт. (1971), используя другой метод, основанный на определении числа З'-концов, оценили минимальное число фрагментов РНК в одном вярионе и получили число 7. Таким оо-разом, в настоящее время, вероятно, можно утверждать, что

геном вируса гриппа состоит из 6—7 индивидуальных молекул РНК1. Неопределенность в знании точного числа фрагментов, содержащихся в одной вирусной частице делает 'невозможным точное определение относительной молекулярной массы вирусного генома. Однако оценка, основанная на необходимом для синтеза вирусспецифических полипептидов количестве  информации, позволяет  утверждать,  что  вирусный

геном должен иметь молекулярную массу не ниже 3,5-106— 4- 10е. Lewandowski и соавт. (1971) определили, что суммарная молекулярная масса описанных им семи фрагментов РНК должна -быть не ниже 4,7-107.

Недавно мы применили новую систему для электрофореза с использованием вместо цилиндрических гелей плоских («слаб-гели»). Этот метод позволил показать, что геном вируса гриппа состоит из 8 отдельных кусков онРНК. При изоляции днРНК из инфицированных «слеток также наблюдалось 8 фрагментов днРНК. В обоих случаях фрагменты РНК группировались следующим образом: 3 больших фрагмента с -близкой молекулярной массой, 3 фрагмента с промежуточными размерами и с резко различающейся молекулярной массой и 2 малых по размерам фрагмента. Palese, используя аналогичный метод анализа онРНК, получил 9 фрагментов РНК (Palese, персональное сообщение). Присутствие 9-то и следующих по номеру фрагментов РНК (имеющих более низкую по сравнению с остальными фрагментами .молекулярную массу), вероятно, имеет отношение к множественности заражения.

Рибонуклеиновая кислота вируса гриппа может быть проанализирована с помощью МАК-1К0ЛОНОК по методу, описанному Mendall и Hershey (1960). В режиме градиентной элю-ции вРНК элюируется с таких колонок при 1 М NaCl (Pons, 1967а) в виде отдельного пика. Последующий анализ этой РНК при разделении с помощью скоростной седиментации показал, что РНК седиментирует в широкой области со средним коэффициентом седиментации 18S. Таким образом, использование МАК-колонок для исследования изолированной вРНК имеет ограниченные преимущества перед другими методами, однако эта методика крайне удобна при анализе РНК, выделенной из инфицированных .клеток. При хроматографии на МАК-колонке такой РНК, изолированной с помощью смеси фенол-SDS, происходит разделение вирусных онРНК и днРНК. Однонитчатая РНК элюируется вместе с 285-рибосомальной РНК клетки-хозяина. Если такую смесь РНК клетки-хозяина и вируса попытаться разделить с помощью скоростной седиментации, РНК (имеющая среднюю константу седиментации 18S) и 28S-PHK клетки-хозяина выйдут в разных фракциях. Этим методом можно получить относительно чистую вРИК, изолированную из .клетки.

Ш. ФИЗИЧЕСКИЕ И ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РНК ВИРУСА ГРИППА

А. РНК ИНФЕКЦИОННОГО ВИРУСА

В предыдущих разделах мы описали различные методы, которые были использованы для выделения и анализа вири-онной РНК. За исключением одной работы Li и Seto (1970), утверждавших, что 'РНК, изолированная из вирусных частиц, может быть получена в виде отдельной полимерной молекулы, видной в электронном микроскопе, все данные, описанные многочисленными авторами, указывают на то, что вирусная РНК фрагментирована. Как 'было указано выше, существует несколько мнений о точном числе фрагментов РНК, входящих в состав одной вирусной частицы. Это обстоятельство не позволяет определить относительную молекулярную массу вирусного генома с какой-либо степенью определенности.

Duesberg и Robinson (1967) определили ну-клеотидный состав вРНК, изолированной из штамма PR8: урацила 33%, цитозина 24%, аденина 23% и гуанина 19,5%." Ранее Ada и Perry (1956) обнаружили, что нуклеотидный состав вРНК, хотя и слабо, но определенно варьирует от штамма к штамму. Нуклеотидный состав вРНК, а также ее чувствительность к РНК-азе указывают на то, что она однонитчатая. Поскольку не наблюдается еамогабридизации между молекулами РНК, изолированными из вирпонов, онРНК в составе различных вирионов представлена цепочками одной полярности. (Scholtissek, Becht, 1971; Pons, 1971).

Важным свойством РНК вируса гриппа является ее фрагментарность. Вероятно, большое число биологических свойств вируса, которые отличают его от большинства других вирусов животных, могут 'быть объяснены на основании этого факта. Хотя некоторые вирусы растений, по-видимому, имеют фрагментарный геном, в настоящее 'время показано, что, .кроме вируса гриппа, фрагментированную РНК содержат только рео- и онкорнавирусы1. В настоящее время фрагментарность генома вирусов гриппа подтверждена физическими, химическими и биологическими методами.

Седиментационный анализ меченой РНК, экстрагированной из очищенных вирусных частиц, привел многих исследователей к независимому выводу о том, что эта РНК имеет относительную молекулярную массу, слишком малую для 'кодирования информации, необходимой для синтеза вирус-специфических полипептидов (Davis, Barry, 1966; Duesberg, Robinson, 1967; Nayak, 1969; Pons, 1967a). В двух последних работах была описана изоляция РНК с высокой молекулярной массой (Agrawal, Bruening, 1966), однако, как сейчас ясно, полученные результаты, вероятно, связаны с агрегацией фрагментов РНК или с наличием неполностью депротеини-знрованных молекул РНП. Анализ вРНК, проведенный Duesberg (1968), Pons и Hirst (1968а) с помощью ПААГЭ, показал, что геном вируса представляет собой сумму по крайней мере пяти фрагментов РНК. Позже было обнаружено, что вирусспецифические донРНК, экстрагированные из инфицированных клеток, также представляют собой смесь фрагментов, которые после разделения на онРНК при плавлении имели те же электрофоретичесше подвижности, что и РНК, выделенные из вирионов (Pons, Hirst, 1968). Эти факты подтвердили точку зрения, что наличие фрагментов имеет биологическое значение и не связано с простыми деградационными процессами во время выделения РНК-

Приведенные биохимические эксперименты показали, что вирусный геном фрагментарен. Существует также несколько биологических фактов в пользу этого вывода. Высокая частота рекомбинаций, полученная при генетических скрещиваниях вирусов гриппа, указывает на наличие механизма, сходного со случайной пересортировкой сегментов, а не на процесс классической генетической рекомбинации с кроссинговерам между отдельными видами РНК (Simpson, Hirst, 1961; Hirst, 1962). Scholtissek и Rott (1969) обнаружили, что байер-139 (Вауег-139) инактивирует свойства вируса ступенчатым образом. Это указывает на наличие у вируса мультикомпонент-ного гнома. Опыты по множественной реактивации (Hend, Liu, 1951; Barry, 1961) и ультрафиолетовой инактивации (Joss et al., 1969; Gandi, Burke, 1970) были также интерпретированы как возможное доказательство существования мультикомпонентного генома.

Хотя данные биохимических и .биологических исследований наводили на мысль о существовании фрагментарного генома, наиболее доказательными экспериментами в пользу этого предположения были следующие: Young и Content (1971) разделили с помощью скоростной седиментации в РНК на фрагменты трех размеров. Каждый из трех классов фрагментов обладал собственным 5' концом вида рррАр. Le-wandowski и соавт. (1971) показали, что да З'-конце находится нефосфорилированный уридин (У-ОН). 'Кроме того, Content и Duesberg (1971) обнаружили разницу в последовательности оснований у трех различных по размерам классов вРНК, a Horst и соавт. (1972) показали наличие разных олигонуклеотидов в каждом из названных фрагментов РНК. Эти данные, при учете описанных ранее, позволяют сделать вывод, что крайне маловероятно, или даже невозможно, возникновение фрагментов РНК за счет расщепления одной ко-валентно   непрерывной   однонитчатой   молекулы   РНК

Таким образом, ясно, что геном вируса гриппа фрагмен-тирован. Однако нет каких-либо доказательств в пользу того, что имеет место связь между отдельными фрагментами, такая, например, как перекрывание комплементарных (концов. Поскольку вируоспецифическая РНК, -изолированная из инфицированных клеток, также фрагментирована, не совсем ясно, каким образом при созревании вируса в его состав включается нужное число нужных фрагментов РНК. Этот вопрос будет обсужден в разделе V этой главы.

Б. РНК, ИЗОЛИРОВАННАЯ ИЗ НЕПОЛНОГО (ФОН-МАГНУСОВСКОГО) ВИРУСА

Одна из особенностей вируса гриппа состоит в том, что при последовательных пассажах на куриных эмбрионах или клеточных культурах при высокой множественности заражения продуцируется сниженное количество инфекционного вируса при сохранении высокого титра гемагглютинации. Этот вирус с низкой инфекционностыо и высокой гемагглютиниру-ющей активностью называется неполным, или вирусом фон-Магнуса (von Magnus, 1954). Duesberg (1968) с помощью метода ПААГЭ обнаружил, что неполный вирус имеет сниженное содержание фрагментов РНК с большой молекулярной массой. Pons и Hirst (1969) показали, что после двух пассажей с высокой множественностью заражения в неполном вирусе резко снижается содержание только самого большого по размерам фрагмента РНК, в то время как лоллпептидный состав его меняется лишь количественно. Необходимо отметить, что хотя мы упомянули об этом самом большом по молекулярной массе фрагменте как об «утерянном» в процессе формирования неполного вируса, нельзя исключить возможность его присутствия во фрагментированном виде. Это может произойти, если РНК расщепляется в одной или большем количестве точек цепи. РНК в этом случае будет присутствовать в вирионе, но будет мигрировать в полпак-риламидном геле в новом месте, а это может привести к заключению об отсутствии фрагмента в вирусном препарате. Однако в настоящее время нет экспериментального доказательства этой точки зрения.

Choppin (1969) обнаружил, что несколько последовательных пассажей вируса гриппа штамма WSN с высокой множественностью заражения на клетках MDBK не приводят к образованию заметных количеств неполного вируса. С другой стороны, один пассаж этого вируса на клетках HeLa приводит к продукции неинфекционных НА-частиц (Henle et al., 1955; Hillis et al., 1960; White et al., 1965; Ter Meulen, Love, 1967). Choppin и Pons (1970) исследовали РНК вирусов, выращенных на клетках MDBK и HeLa, и обнаружили,,

что для вируса, выращенного на клетках MDBK, наблюдалось лишь небольшое снижение количества самого большого по размерам фрагмента РНК, и только после четырех последовательных пассажей с высокой множественностью заражения его количество снижалось в значительной степени (в отличие от двух пассажей на куриных эмбрионах и монослоях клеток CEF). В клетках HeLa одного пассажа вируса, культивированного ранее на .куриных эмбрионах, было достаточно для элиминирования самого 'высокомолекулярного фрагмента РНК. Larner и Hodge (1969) определили, что в клетках HeLa, инфицированных вирусом гриппа штамма PR8, синтезируются все семь фрагментов днРНК. Однако эти авторы не анализировали состав онРНК неполных вирусных частиц.

Описанные результаты указывают на то, что клетка-хозяин играет значительную роль в репликации вирусной РНК, хотя природа этого влияния еще неизвестна. Неясен также механизм, согласно которому отдельный фрагмент РНК элиминируется из вириона, хотя и было предложено следующее объяснение этого явления (Choppin, Pons, 1970). Поскольку репликация меньших по относительной молекулярной массе фрагментов РНК заканчивается раньше, чем репликация больших фрагментов (Mills et al., 1967; Spigelman et al., 1968), избыточное количество частиц вируса гриппа в клетке может привести к истощению пула нуклеотидов или другого химического соединения (других химических соединений), необходимого для синтеза больших по размерам молекул РНК- Эта гипотеза о конкурентной репликации малых фрагментов РНК исходит из предположения о независимости синтеза каждого отдельного фрагмента от синтеза других фрагментов, а также из случайного процесса упаковки фрагментов РНК в вирион (Compans et al., 1970). С тех пор как эта гипотеза была сформулирована, Bishop и соавт. (1972) показали, что каждый фрагмент РНК несет на себе свою собственную молекулу полимеразы. Это явилось аргументом в пользу описанного механизма.

IV. КОМПЛЕКС РНК С БЕЛКОМ (РНП) А. ФИЗИЧЕСКИЕ И ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

При разрушении вирионов гриппа с помощью эфира (Hoyle, 1952; Lief, Henle, 1956; Davenport et al., 1959), дезоксихолата натрия (Duesberg, 1969; Kingsbury, Webster, 1969) или нонидета P40 (NP40) (Ponsetal., 1969) высвобождается стабильный комплекс РНК с белком. Этот нуклеопро-теид (РНП) содержит 10% РНК и 90% белка. Белковая компонента РНП имеет относительную молекулярную массу

около  55 000—65 000  и  обозначается  символом   NP    (Pons et al.,  1969).    Скоростное    градиентное    центрифугирование РНП в  10—35%   глицериновом градиенте  с 'использованием буфера STEU позволяет разделить РНП на три типа молекулярных  комплексов  со  средними  коэффициентами  седиментации 48, 40 и 34S  (Pons,  1971). Duesberg  (1969), а также Kingsbury и Webster   (1969)   тоже изолировали  три класса различных по размерам РНП, но с более высокими значениями коэффициентов седиментации—приблизительно  70, 60 и 50S. Разница в приведенных значениях коэффициентов седиментации, вероятно, связана с различием методов изоляции и анализа РНП, который имеет тенденцию IK агрегации в отсутствие мочевины или в растворах с низкой концентрацией солей.  После  фиксации  РНП  с помощью  глютаральдегида его плавучая плотность в хлориде    цезия    равна   1,34 г/см3 (Krug, 1971).

Pons    (1971), используя анализ изолированного  РНП с помощью   ПААГЭ,  доказал  предположение   Duesberg   (3969), Kingsbury и Webster (1969) о том, что каждый из различных по относительной 'молекулярной массе фрагментов РНП, изолированных с помощью центрифугирования в градиенте плотности,   представляет  собой   комплекс  разных   по   размерам молекул РНК с белком NP. В настоящее врехмя нет доказательств   существования   единой   цепочки   РНП     (структура, в которой  фрагменты РНК удерживаются  на  непрерывной цепи субъединиц NP) как в вирмоне, так и в инфицированной клетке.

В отличие от РНП парамиксовирусов (Compans, Choppin, 1967) РНП вируса гриппа чувствителен к действию РНК-азы (Duesberg, 1969; Pons et al., 1969). Обработка РНП проказой приводит к расщеплению -белка NP и к высвобождению вирусной РНК (Pons et al., 1969). Мяша(я обработка проназой не вызывает деградации белка NP  (Duesberg,  1969). Приведенные экспериментальные    данные  указывают  на  стериче-окую доступность как 'белка, так и РНК, входящих в РНП-комплекс, хотя каждая из составных частей РНП и экранирует связанную с ней макромолекулу.

Pons  и  соавт.   (1969)  провели  электронно-микроскопическое изучение изолированного РНП, оттеняя его с помощью укранилацетата или негативно контрастируя его фосфоволь-фраматом калия. Наблюдаемые структуры имели спиральные или окрученные торцовые сечения с противоположио направленными глубокой и мелкой бороздками и с петлями на каждом из концов. Эти структуры -были различной длины: в пределах от 50 до 150 нм и постоянной толщины: 15 ям    (7,5 нм для концевых петель) (Schuize et al., 1970)  (29, A). Corn-pans и соавт. (1972) получили аналогичные результаты и показали,  что длина каждого из  фрагментов  РНП  отражает

длину молекулы РНК, входящей в его состав. Морфологически РНП представляет собой комплекс, состоящий из РНК и белка, закрученный сам на себя с образованием высоко-спиральной структуры, причем ни РНК, ни белок не являются чехлом для другой макромолекулы, входящей в состав рибонуклеопротеида.

Scholtissek и Becht (1971) показали, что белок NP имеет одинаковое сродство к вРНК и >к вкРНК- Он также присоединялся к клеточным РНК, содержащим в большом количестве АМФ, и к другим одноцепо'чечным РНК. С двунитчаты-ми РНК белок не взаимодействовал. Как 'было указано, РН'П-комплеке стабилен в 1 М мочевине, а также в 0,8 М Nad или в 1 М КС1. В условиях in vitro, по-видимому, нет высокой специфичности во взаимодействии между молекулами белка NP и РНК- Другого рода указание о потере специфичности 'было    проведено в исследованиях    Pons и соавт.(1969), Goldstein и Pons (1970). Как показали эти авторы поливинилсульфат (PVS) вытесняет РНК с белкового остова, что -приводит к возникновению комплекса PVS-NP, который имел седиментационные свойства и морфологию, сходную с исходным РНП (29,.6). Свободная вирусная РНК, се-диментирующая при 18S, была чувствительна к расщеплению РНК-азой, как это наблюдается для РНК, выделенной с помощью фенольного метода, в то время как комплекс PVS-NP был нечувствителен к действию РНК-азы. Результаты описанных экспериментов указывают на то, что морфология РНП в основном определяется взаимодействием между молекулами NP. Действительно, комплекс имеет сходную структуру вне зависимости от того, связывается ли молекулуа NP с РНК или с резко отличной от нее (Молекулой PVS. Кроме того, .комплекс PVS-NP, идентичный физически и морфологически РНП, может быть получен только в случае, когда PVS добавляется к ннтактному РНП. Добавление PVS к свободным субъединицам NP приводит к возникновению гетерогенной смеси молекул (комплекса PVS-белок, который не сходен с РНП ни в еедиментационном, ни в морфологическом отношении. Взаимодействие PVS с РНП также указывает на то, что, как .было отмечено Schulze (1973), в формировании РНП играют роль в основном зарядовые взаимодействия между молекулами белка и фоофоэфиряого остова РНК, поскольку РНК может быть заменена полимером, содержащим в своем составе заряженные фосфатные группы.

Для изоляции РНП из инфицированных клеток 'было разработано несколько различных методов (Pons, 1971, 1972). При использовании любого из них выделялся РНП, плавучая плотность, коэффициент седиментации и морфологические характеристики которого были идентичны характеристикам ви-рионного РНП. Имелось только одно различие между РНП, выделенными из вирионов и из инфицированных клеток: ви-рионный РНП состоял из белка, находящегося в комплексе только с вРНК, в то время как 90% клеточного РНП содержало вРНК, а 10% — BIKPIHK. В отличие от Krug (1972), который обнаружил свободную BIKPHK В инфицированных .клетках, мы не обнаружили свободной вирусспецифической РНК в клетке (кроме днРНК). Наш метод выделения давал нам всю внутриклеточную вирусспецифичеокую РНК в виде РНП. Причины приведенного различия в результатах пока неясны.

Б. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РНП

До сих пор нет доказательства того, что белковая часть РНП играет какую-либо другую роль, кроме осуществления функции защитного чехла для РНК. Возможно, что сегменты

РНК могут быть связаны в единую цепь на непрерывном остове NP-белка. Хотя такого рода структура и не обнаруживалась, тем не менее была предложена модель репликации РНК, предполагающая ее существование (Pons, 1970). Кроме того, белок NP или сам РНП может обладать некоторой регуляторной функцией при транскрипции, трансляции или репликации. Ответы на эти вопросы могут быть найдены в процессе изучения транскрипции и трансляции в системе in vitro.

Hir'st и Pons (1972) обнаружили, что вирусные экстракты, содержащие РНП штамма вируса гриппа дикого типа (WSN), имели более высокую восстанавливающую активность (marker rescue) в опытах с температурочувствительны-ми мутантами. Природа и строение вещества, вызывающего эффект .восстановления, неясна, однако свободная вирусная* РНК, выделенная из вирионного РНП с помощью смеси фенол—SDS или при обработке его лолививидеульфатом, была: полностью неактивна в этом отношении. Существенно ли для: восстановительных свойств препарата присутствие в системе: только белка NP или смеси этого белка с полимеразой — еще не ясно.

V. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ВИРУССПЕЦИФИЧЕСКИЕ РНК

А. ВИРИОННАЯ РНК

1. Синтез вРНК

Несмотря на то что до настоящего времени было выполнено большое число работ, посвященных изучению синтеза РНК 'вируса гриппа в клетке-хозяине, интерпретация их результатов была осложнена в результате того, что вирусная репликация ингибировалась в присутствии актиномицина D (AD). Некоторые авторы (интерпретируют свои результаты, считая, что синтез вирусной РНК становится нечувствительным к AD спустя 2—27г ч после начала инфекции (Barry et al., 1962; Barry, 1964; Granoff, Kingsbury, 1964; Kingsbury, 1970; Blair, Duesberg, 1970). Тем не менее имеется другая точка зрения, согласно которой AD обладает ингибирующим действием вне зависимости от времени его введения в систему (Scholtissek, Rott, 1970; Gregoriades, 1970; Pons, 1973). Эти работы будут подробно обсуждены в разделе VIA. Мы: подняли здесь этот вопрос только для того, чтобы подчеркнуть тот факт, что исследования, о которых будет сказано далее, в основном были выполнены без применения каких-либо ингибиторов синтеза вирусной РНК и в связи с этим потребовали значительных усилий для разделения вирусспепифических продуктов и продуктов клетки-хозяина в процессе созревания вируса.

Как указывалось в разделе ПВ, 1 вирусспецифические РНК имеют среднее значение 'коэффициента седиментации, равное 18S. Рибоеомалыные РНК клеток-хозяев млекопитающих седиментируют при 28 и 18S. Таким образом, при использовании ингибиторов синтеза рибосомальной РНК клетки-хозяина трудно сделать какие-либо заключения о синтезе вирусной РНК. в связи с тем, что 18S РНК входит в состав как вируса, так и клепки-хозяина. Для преодоления этой трудности был разработан метод выделения из клетки вирусных РНК в виде РНП. Р'ибонуклеопротеид имеет средний коэффициент седиментации 30—50S, стабилен в присутствии ЭДТА, высоких концентраций солей и мочевины (эти виды обработки разрушают рибосомы клетки-хозяина) и может быть сконцентрирован осаждением в изоэлектричеекой точке (Schafer, Munk, 1952). Используя эти свойства РНП, для его изоляции инфицированные клетки разрушают с помощью NP-40, РНП извлекают и концентрируют с помощью преципитации в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,5 и очищают скоростным центрифугированием 1—2 раза через глицериновый градиент (Pons, 1971). Изолированный и очищенный таким способом РНП имеет плавучую плотность, седиментационные характеристики и морфологию вирионного РНП. Однако в то время как вРНК не обладает способностью ж самогибридизации, до 20% РНК, выделенной из внутриклеточного РНП, самогибридизуется. Эти данные совместно с данными конкурентной самогибридизации указывают на то, что внутриклеточный РНП содержит 90% вРНК и 10% вкРНК (Pons, 1971).

Scholtissek и соавт. (1969) сообщили, что синтез вирусной РНК связан с синтезом полипептида NP. Этот факт позволяет изучать кинетику синтеза вирусной РНК по возникновению в клетке РНП. Кроме того, использование методов, разработанных для изучения внутриклеточного синтеза в процессе клеточной репликации, 'позволило высказать точку зрения, что в клетке нет свободных вируослецифических РНК (Pons, 1971, 1972). Это означает, что, как только происходит синтез цепи РНК (или даже во время самого синтеза), она ассоциируется с молекулами 'белка NP. Krug (1971), однако, интерпретировал полученные им данные на основе .предположения о том, что синтез вкРНК происходит намного раньше, чем образование вкРНП. Несмотря на это несоответствие точек зрения, по-видимому, все же правомочно рассматривать синтез РНП в качестве критерия синтеза РНК. Pons (1971) показал, что РНП можно обнаружить уже через 1 ч после начала инфекции. Ранее было обнаружено, что вирус-специфическая днРНК может быть, найдена в клетке спустя

'/г ч после начала инфекции (Pons, 1967b). Это различие можно объяснить просто методологическими трудностями экстраполяции кривой синтеза РНП в начальной точке отсчета времени. Кинетика синтеза РНП имеет все черты, характерные для синтеза самореплицирующихся молекул (Pons, 1971).

В заключение следует отметить, что полученные данные указывают на то, что синтез вирусной РНК, наблюдаемый по возникновению РНП, начинается почти сразу же после начала инфекции. Асимптотическое поведение кривой кинетики накопления РНП указывает на наличие самодуллицирующихся молекул. В случае использования монослоев клеток куриных фибробластов синтез РНП начинается максимум через 4—5 ч после инфекции, когда во внеклеточной жидкости обнаруживаются вновь синтезированные вирусные частицы, и некоторые кленки деградируют. Другой аспект проблемы внутриклеточного синтеза вирусной РНК состоит в том, где синтезируется эта РНК- Этот вопрос будет рассмотрен в гл. 8.

2, Созревание и упаковка РНК в вирионы

Механизм, согласно которому РНК (или РНП) упаковывается в вирусную частицу, до настоящего времени неизвестен. Ясно, что имеет место процесс отбора, в результате которого во вновь формируемые вирусные частицы включаются только РНП, содержащие молекулы вРНК (но не вкРНК). Можно предположить, хотя в настоящее время и нет прямых доказательств этого утверждения, что на ранних этапах созревания вирионов в сборке участвуют какие-то полимерные молекулы (вероятно, .молекулы М-белка), содержащие места для «узнавания» вРНК- Если такой инициатор-ный механизм имеет место, то молекулы других полипептидов или субъединицы того же белка конденсируются вокруг РНП и начинается процесс самосборки, который заканчивается отпочкованием цельных вирусных частиц от тех специфических участков клеточных мембран, которые ранее претерпели изменения и содержат вирусные компоненты.

Выяснение вопроса о том, как полный набор фрагментов вирусной PiHK (в виде РНП) упаковывается в отдельную1 вирусную частицу,—сложная задача, особенно при учете фрагментарности вирусного генома. Хотя мы и не можем исключить возможность «выстраивания» фрагментов РНК или связывания их упорядоченным образом на непрерывном белковом остове, в настоящее время нет достаточных доказательств этого утверждения. Compans и соавт. (1970) рассчитали, что если для формирования полного вирусного генома требуется 5 фрагментов и если в действительности упаковывается случайным образом 7 фрагментов, около 22% вирусных частиц будут содержать полный набор из пяти необхо-

димых фрагментов РНП. В настоящее -время обнаружено, что в каждом вирионе содержится по .крайней мере шесть или семь фрагментов. Таким образом, если признать правильной приведенную схему, необходимо предположить, что в процессе упаковки в каждую вирусную частицу должно лопасть 9—10 фрагментов РНП. Хотя это и немного завышенная величина, если основываться на данных химического анализа содержания РНК в одной вирусной частице, эту возможность нельзя исключить. Такой механизм созревания вместе со способностью вирионов ж агрегации и увеличения за счет этого своей инфекционное™ (Hirst, Pons, 1973) дает вирусу гриппа преимущества в борьбе за существование в природе. Один экспериментальный подход к данному вопросу крайне полезен, но на практике он очень сложен в техническом отношении. Если предположить, что репликация фрагментов РНП осуществляется случайно, можно ожидать следующее. Случайный, или неупорядоченный, синтез фрагментов РНП должен привести к избыточной продукции меньших по размерам фрагментов. Это предположение основано на том, что молекула полимеразы каждого фрагмента РНП (Bishop et al., 1972) реплицирует РНК с одинаковой скоростью. Вследствие этого самый маленький по размерам фрагмент РНП, длина (которого составляет 7з длины наибольшего из фрагментов, будет реплицироваться в 3 раза большем количестве. Полученные нами данные не подтверждают это предположение Bishop и соавт. (1972). Соотношение между количеством разных фрагментов 'было равно 2:1:1:1:2 — от самого .большого по размерам фрагмента к самому малому (Pons, неопубликованные данные). Отсюда можно сделать вывод, что, хотя яри формировании зрелых вирионов фрагменты вирусспецифических РНК « могут включаться в вирусную частицу случайно, их репликация или транскрипция каким-то образом регулируется или контролируется. Если включение фрагментов РНП в вирлон подчиняется законам случайных процессов, то их относительное распределение должно быть одинаковым как при выделении из вирионов, так и при изоляции из внутриклеточного пула. Предварительно полученные данные были неоднозначны в связи с большими техническими трудностями при постановке опытов, заключающимися в присутствии в популяции неполного вируса и отсутствии синхронности инфекционного процесса в разных клетках.

Б. КОМПЛЕМЕНТАРНАЯ ИЛИ ИНФОРМАЦИОННАЯ РНК {вкРНК)

1. Внутриклеточная локализация вкРНК

Было показано, что РНК, комплементарная вРНК, ассоциирована в инфицированных клетках с полисомами (Pons, 1972). Установлено (см. раздел Va, 1), что 10% внутриклеточ-

ной вирусспецифичеокой РНК, изолируемой в виде РНП, представляет собой вкРНК. Однако после фракционирования клеток было обнаружено, что большая часть вирусспецифи-ческой РНК, ассоциированной с лолиоомами, была представлена вкРНК (Pons, 1972). Недавно Etkind и Krug (1974) сообщили, что вся полиеомная РНК представляет собой вкРНК. Этот вывод не согласуется с нашими данными, поскольку в нашей работе мы вынуждены были использовать коррекцию для учета вклада РНК клетки-хозяина. Etkind м Krug (1974) провели тщательное удаление всех контамини-рующих РНК клетки. По-видимому, вирус гриппа .подобен другим вирусам, содержащим в составе своих вирионов РНК-зависимую PiHK-лолимеразу (например, вирус везикулярного стоматита), и в связи с этим способен к синтезу функциональной информационной РНК через короткое время после начала инфекционного процесса.

Другого рода экспериментальный подход позволил полу

чить данные, интерпретация (Которых может привести к за

ключению о том, что природа информационной РНК отлична

от той, о которой говорилось ранее. Эти данные крайне про

тиворечивы н в настоящее время могут рассматриваться

лишь как предварительные. Siegert и соавт. (1973) сообщили

о синтезе полипептида NP в Е. coli бесклеточной белоксинте-

зирующей системе при использовании в качестве информа

ционной РНК 'вРНК. Kingsbury и Webster (1973) получили

прямо противоположные результаты, обнаружив, что вРНК

не может выступать в качестве информационной в бесклеточ

ной системе ретикулоцитов кролика. (В то же время, по их

данным, РНК, изолированная из инфицированных клеток

(смесь вРНК и вкРНК), выступала как иРНК, и ее присутст

вие в системе приводило к синтезу М-белка. На основе этих

прямо противоположных результатов трудно выработать (ком

промиссную точку зрения, однако, учитывая предварительный

характер сообщений, до появления результатов, подтвержда

ющих тот или иной результат, можно с осторожностью пред

положить, что один из фрагментов вРНК -может выступать

в качестве информационной РНК. Данные по самогибриди

зации, полученные Etkind и Krug (1974), а также Pons

(1972), исключают наличие 'больше чем одного фрагмента

вРНК, служащего матрицей как в транскрипции, так и в

трансляции.

2. Кинетика синтеза вкРНК

Работы по изучению синтеза РНП и днРНК, описанные

ранее, показали, что синтез вкРНК начинается очень скоро

*после начала инфекции. Более объективное изучение синтеза

именно этого типа РНК может быть проведено путем иссле-

давания появления вкРНК на полисомах. Клеши метят в течение короткого интервала пульсовой меткой [3Н]-уридином в различные моменты после начала инфекции, и полисомы выделяют и анализируют .после экстракции с помощью смеси фенолхлороформ— SDS. Полученные результаты показали, что после начального периода угнетения формирования полисом клеток-хозяев синтез вкРНК непрерывно растет. Основное количество вкРНК синтезируется через 2'/г—3 ч после начала инфекции, после чего скорость ее синтеза снижается (Pons, в печати). Аналогичные данные привели Krug и Et-kind (1973), изучавшие синтез РНК :в цитоплазме и ядрах инфицированных клеток. Эти авторы показали, что синтез вкРНК заканчивается через 4 ч после начала инфекции. Таким образом, приведенные данные указывают на то, что синтез вкРНК начинается сразу же после начала инфекции и заканчивается через 4 ч. Спустя это время вновь синтезированные вирусные частицы обнаруживаются вне клетки. Природа такого «отсекающего» механизма в настоящее время неизвестна.

3. Физические свойства информационной РНК (мРНК)

При изучении вкРНК, ассоциированной с полисомами (мРНК), обнаружено, что основное количество, если не вся мРНК, находится >в виде РНП. Полисомы изолировали, разрушали высокой концентрацией соли, ЭДТА и пуромицина (Blobel, 1971), и полученную таким образом мРНК подвергали анализу. Менее 2% вкРНК находилось в свободном виде, оставшиеся 98% составлял РНП. Большие предосторожности были приняты для того, чтобы убедиться, что полипептид NP (единственный яолипептид, ассоциированный с изолированной мРНК) неспецифически не адсорбируется на свободную мРНК в процессе самой изоляции. Трудно убедиться в том, что мРНП представляет собой «непрерывный» РНП, т. е. не имеет участков, свободных от белка, однако, основываясь на седикентационных характеристиках изолированного мРНП и его плавучей плотности в CsCl, можно сделать вывод, что, по-видимому, по своим физическим свойствам мРНП идентичен вирионному.

Большое число исследователей высказывали точку зрения, что мРНК млекопитающих существует и функционирует как иРНК в виде РНП (Spirin, Nemer, 1965; Spirin, 1966; Perry, Kelley, 1968; Henshaw, 1968; Kumar, Lindber, 1972; Bryan, Hayashi, 1973; Gross, 1968; Spirin, 1969). Ясно, что мРНП, будучи более устойчивым к расщепляющему действию РНК-аз, будет более стабилен, чем свободная мРНК. Однако не совсем ясно, как транслируется такая молекула. По-видимому, этот процесс должен включать диссоциацию субъединиц по-

липелтида с РНК в месте контакта рибосомы с мРНК. Возможно также, что полипептидная часть комплекса играет ре-гуляторную роль в процессе трансляции. Полное решение всех этих проблем будет возможно лишь при исследовании белоксинтезирующих систем.

VI. ДЕЙСТВИЕ ИНГИБИТОРОВ НА СИНТЕЗ РНК

Л. АКТИНОМИЦИН D

Ранее мы уже указывали (см. раздел1 VA, 1), что AD полностью ингибирует синтез вкРНК вне зависимости от того, на каком этапе репликативного цикла он вводится в систему, и лишь в малой степени подавляет синтез вРНК (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). По данным Gregoriades (1970), вкРНК, синтезированная до начала ингибирования ее синтеза, продолжает функционировать как иРНК в течение по крайней мере 17 ч после добавления AD. Как установлено в настоящее время, по-видимому, интерпретация данных была прямо противоположна у исследователей, стоящих на точке зрения, что AD вообще не обладает ингибиторными свойствами, если его добавляют спустя 2—3 ч после начала инфекции (Barry et al., 1962; Barry, 1964; Granoff, Kingsbury, 1964), и тех, кто считает AD способным обладать ингибитор-ным эффектом при добавлении его в любое время (Pons, 1967b; Scholtissek, Rott, 1970). Истина, вероятно, лежит где-то между этими двумя точками зрения. Актиномицин D ингибирует синтез вкРНК вне зависимости от момента появления его в клетке, в частности, если AD добавляют до момента, когда в клетке уже синтезировалось большое число молекул мРНК- Именно это является причиной снижения скорости синтеза вирусных полипептидов. Если же AD добавляют после того, как уже синтезировалось значительное количество молекул вкРНК, и этого количества достаточно для производства полипелтидных молекул и для того, чтобы на них, как на матрице, синтезировались молекулы вРНК, то синтез вирусных частиц будет проходить с нормальной скоростью.

Таким образом, начиная с этого момента, AD проявляет себя как безингибиторное вещество. Необходимо подчеркнуть, однако, что AD является ингибитором синтеза вкРНК и должен использоваться с осторожностью при изучении синтеза внутриклеточных макромолекул.

Природа ингибиторного действия AD на синтез IBKPHK В настоящее время неясна, поскольку AD эффективен при введении в «летку до начала инфекции. Вполне возможно, что AD подавляет какой-то клеточный механизм, необходимый для синтеза вкРНК. Это означает, что функциональная хозяйская ДНК, но не ее синтез (Burry, 1964), необходима для

репродукции вируса. AD не ингибирует синтез вкРНК in vitro (Chow, Simpson, 1971), во, как ни странно,, подавляет внутриклеточную транскрипцию (Bean, Simpson, 1973). Можно сделать вывод, что AD ингибирует синтез какого-то клеточного фактора (или факторов), необходимого для процесса транскрипции. Этот фактор отсутствует в системе in vitro, и, хотя некоторый синтез вкРНК и происходит, этот процесс может в значительной мере стимулироваться добавлением клеточного фактора   (Rochovansky, персональное сообщение).

Работе по исследованию синтеза РНК вируса гриппа мешала невозможность провести эксперименты лульс-чейза на монослоях клеток куриных фибробластов; клетки продолжали включать меченый уридин даже в присутствии большого избытка немеченого нуклеинового основания. Недавно AD использовали для блокировки включения меченого уридина в вкРНК, ассоциированную с полисомами. Хотя это не 'был «чейз» в правильном значении этого слова, такая обработка позволила проследить судьбу предсуществующей вкРНК. Было показано, что после того, (как вкРНК 'была изолирована из инфицированных клеток после короткой пульсовой экспозиции (30 мин) меченым основанием, большая часть РНК седиментиро'вала в области 14S. При увеличении времени экспозиции коэффициент седиментации увеличивался, пока при экспозиции Р/г ч не достигал средней величины 18S и распределения, характерного для вРНК-

При обработке клеток пульсовой меткой в течение 30 мин и добавлении затем AD в разное время при отсутствии метки был показан некоторый сдвиг в распределении меченой РНК при ее скоростном седиментационном анализе. Непосредственно после действия метки приблизительно 70% меченой вкРНК наблюдали в области 9—15S и 30% —в области 15—• 22S (РНК, экстрагированная из вирионов, имела следующее распределение: 20% в области 9—15S и 80% в области 15— 22S). В конце 30-минутного периода экспозиции меткой изотоп убирали, добавляли AD и аликвоты суспензии клеток отбирали каждые 30 мин. После 60-минутной экспозиции с AD (при увеличении экспозиции дальнейших изменений не наблюдалось) метка распределялась следующим образом: 40% в области 9—15S и 60% в области 15—22S; эти величины находятся между величинами, характерными для вРНК и вкРНК в конце 30-минутного действия пульсовой метки. Важно то, что значительное увеличение включенной метки в 15— 22S РНК не обусловлено увеличением количества этой РНК, а связано с уменьшением количества 9—15S РНК- Эти результаты могут быть интерпретированы с учетом того, что AD, как и было ранее предположено, ингибирует синтез вкРНК. Однако уменьшение количества меньших по размерам фрагментов вкРНК может означать не то, что РНК яа-

ходятся в избыточном количестве, а скорее то, что имеет место наличие неполных молекул РНК большой молекулярной массы. При прекращении их синтеза с помощью AD эти находящиеся в состоянии роста молекулы диссоциируют с полисом, а в ассоциированном с полисомами состоянии остаются только закончившие свой синтез молекулы вкРНК, и они имеют то же относительное распределение по РНК-фрагментам, что и РНК, изолированная из вирионов.

Эти эксперименты были описаны здесь так -подробно для того, чтобы прояснить несколько важных для синтеза вкРНК фактов, ©o-первых, неравномерное распределение молекул вкРНК после относительно короткой пульсовой экспозиции меткой обусловлено скорее присутствием незакончивших свой синтез молекул РНК, а не избыточным содержанием малых по размерам молекул. Как уже было отмечено в разделе VA, 2, если редуллицирование вкРНК случайно и неконтролируемо, то можно обнаружить гораздо больше малых, чем больших, фрагментов РНК- Поскольку такал ситуация не наблюдается IB эксперименте, должен иметь место механизм контроля, определяющий количество синтезирующихся фрагментов данного размера. Во-вторых, поскольку были обнаружены неполностью закончившие свой синтез молекулы РНК (в виде РНП), ассоциированные с полисомами, либо транскрипция вкРНК происходит на цепочке субъединиц полипептида NP, либо этот белок ассоциирует с еще неполной цепью РНК- Этот механизм отличен от механизма, согласно которому сначала синтезируется полная молекула РНК, а затем она лротеинизируетея. Кроме того, в связи с тем что эти неполные молекулы отделяются от полисом, можно заключить, что трансляция вкРНК имеет место в то время, когда цепь еще синтезируется. Такая ситуация наблюдается в большинстве исследованных бактериальных систем.

Б. ЦИКЛОГЕКСИМИД

Циклогексимид ингибирует синтез белков за счет прекращения удлинения полипептидной цепи (Wettstein et al., 1964;  Stanners, 1966; Watanabe et al., 1967). Обработка клеток, инфицированных вирусом гриппа, циклогексимидом снижает синтез вкРНК и полностью блокирует синтез вРНК (Pons, 1973). Эти результаты согласуются с результатами Scholtis-sek и Rott (1970), изучающих суммарные клеточные экстракты с помощью метода самогибридизации.

Природа ингибиторного эффекта циклогексимида еще неясна. Различная чувствительность синтеза вРНК и синтеза вкРНК к действию циклогексимида и AD указывает на то, что в синтезе принимают участие два различных фермента (или если не два фермента, то одна ферментная система с

различными субъединицами, которые могут быть представлены •поляпептвдами как клетки-хозяина, так и вирусспеци-фичеакими), синтез которых чувствителен к присутствию указанных ингибиторов.

В. КОРДИСЕПИН

Кордисепин, являясь ингибитором синтеза лоли-А последовательности (Penman et al., 1970; Darnell et al., 1971), может играть, как 'было установлено на большом числе вирусных и клеточных систем, важную роль IB синтезе функциональных информационных РНК- Клетки (CEF или ВНК-21) инфицировали вирусом гриппа, обрабатывали кордиселином в течение 45 мин в промежутке между 2 и 4 ч после начала инфекции, а затем метили [3Н]-уридином в течение 30 мин. Из клеток акстрагировали полисомы и РНП и сравнивали с полисомами и РНП необработанных инфицированных и контрольных клеток. В инфицированных клетках кордисепин вызывал 70% ингибирование включения метки как в полисо-мы, так и в РНП и 60% ингибирование титра гемаотлютина-ции и выхода инфекционного вируса. Включение метки в полисомы неинфицированных клеток CEF ингабировалось приблизительно на 80%. В клепках ВНК-21 кордисепин не влиял на титр гемагглютинации и инфекционность вируса, ингиби-ровал синтез полисом и РНП лишь в малой степени, однако ингибировал включение метки в полисомы неинфицированных клеток на 86%  (Rochovansky, Pons, 1975).

По данным Etkin и Krug (1974), в мРНК вируса гриппа присутствуют лоли-А участки. Поскольку вРНК не содержит в своем составе комплементарных поли-У фрагментов (Marshall, Gallespie, 1972; Rochovansky, Pons, 1975), участок лоли-А, обнаруживаемый в молекуле вкРНК, должен присоединяться уже после окончания процесса транскрипции. Ясно, что клетки CEF, которые обладают относительно невысокой метаболической активностью, при наших условиях эксперимента [но которые более активны в системе Mahy и соавт. (1973), где кордисепин слабо влияет на продуцирование ви-рионов штамма FPV в клетках CEF] могут быть вынуждены синтезировать некоторые клеточные структуры, такие, как лоли-А, прежде чем продолжить вирусную репликацию. Клетки же ВНК-21 более активны в метаболическом отношении и поэтому могут содержать'более обширный резервуар компонентов клеток-хозяев, необходимых для синтеза вируса. Утверждение о том, что в некоторых случаях синтез клеток требуется для продукции вируса, подтверждается данными работы Mahy и соавт. (1972), в которой показано стимулирование синтеза вируса FPV в клетке CEF ДНК-зависимой РНК-полимеразой П. РНК-полимераза II является ферментом, участвующим в синтезе клеточной мРНК-

VII. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из приведенного 'Обсуждения химических, биологических и морфологических свойств РНК и РНП вирионов гриппа ясно, что геном этого вируса состоит из нескольких фрагментов однонитчатой РНК. Анализ концевых групп различных фрагментов РНК и наличие в составе каждого фрагмента молекул полимеразы делает вполне .вероятной индивидуальную репликацию каждого фрагмента. Однако менее ясен вопрос, как нужное число фрагментов нужного типа упаковывается при формировании инфекционной вирусной частицы. Находится ли процесс отбора фрагментов под контролем какого-то регуляторного механизма или происходит случайно? За счет чего в процессе этого отбора исключается молекула вкРНК? Ответы на эти вопросы ищут в настоящее время в нескольких лабораториях.

С этими проблема1ми связаны также вопросы регуляции транскрипции, трансляции и репликации РНК в инфицированных вирусом клетках. Об этих процессах известно очень мало, хотя они и являются объектом 'Многих исследований. Некоторые ответы на поднятые здесь вопросы будут, по всей вероятности, получены при использовании in' vitro РНК- и белоксинтезирующих систем.

ЛИТЕРАТУРА

Ada G. L., Perry В. Т. Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1954, v. 32, p. 453.    

Ada G. L., Perry B. T. J. gen. Microbiol., 1956, v. 14, p. 623. Agrawal H. O., Bruening G. Proc. nat. Acad. Sci. U. S.; 1966, v. 55, p. 818. Barry R. D. Virology, 1961, v. 14, p. 398.

Barry R. D. Cell. biol. Myxovirus Infect., Ciba Found. Symp., 1964, p. SIBarry R. D., Ives D. R., Cruickshank J. G. Nature  (London), 1962

Bean W. J., Simpson R. W. Virology, 1973, v, 56, p. 646. Bishop D. H., Roy P., Bean W. J., Jr., Simpson R. W.  J. Virol., 1972

Blair С D., Duesberg P. H. Ann, rev. Microbiol., 1970, v. 24, p. 539. Blobel G. Proc. nat. Acad. Sci. U. S., 1971, v. 68, p. 832.

Bryan R. N.. Hayashi M. Nature (London), New Biol., 1973, v. 244, p. 271. Burnet F. M., Science, 1956, v. 123, p. 1101. Choppin P. W. Virology, 1969, v. 39, p. 130. Choppin P. W., Pons M. W. Virology, 1970, v. 42, p. 603. Chow N.. Simpson R. W. Proc. nat. Acad. Sci. U. S., 1971, v. 68, p. 752. Compans R.  W.,  Choppin P.  W.  Proc. nat. Acad.  Sci. U.  S.,  1967

Compans R. W., Content J., Duesberg P. H.  J. Virol., 1972, v. 10,' p. 795. Compans R. W., Dimmock N. J., Meier-Ewert H.   In: The Biology of Large

RNA Viruses (R. D. Barry and B. W. J. Mahy, eds.), New York, Acad.

Content J., Duesberg P. H. J. mol. Biol., 1971, v. 62, p. 273. Darnell J. E.,   Philipson, L.,   Wall R.,   Adesnik M.  Science,    1971,. v.  174