8.4. ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЕ И ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНА

Экстракорпоралное оплодотворение (ЭО) — это оплодотворение яйцеклетки человека в условиях in vitro, культивирование ее и трансплантация эмбриона (ТЭ) в матку.

Первое успешное культивирование ооцита человека в сыворотке крови и экстракорпоральное его оплодотворение, приведшее к развитию двухклеточного эмбриона человека, было осуществлено в 1944 г. J. Rock, М. Melkin. Дальнейшие многочисленные попытки проведения ЭО и кажущийся успех в некоторых случаях оказались несостоятельными, поскольку за дробящийся эмбрион исследователи принимали дегенеративно фрагментирую- щиеся яйцеклетки.

В 1979 г. английские ученые I. Steptol, A. Edwards сообщили, что частота успешного оплодотворения in vitro предовуляцион- ной яйцеклетки составляет 70—80 % и что около 90 % оплодотворенных яйцеклеток развились в эмбрион. После трансплантации 32 эмбрионов в матку только 4 эмбриона дали начало беременности, из которых лишь 2 закончились родами в срок.

В течение последних 8—10 лет ученые прилагают много усилий, направленных на совершенствование методов ЭО и ТЭ. Обнадеживающие результаты получены и во Всесоюзном науч- но-исследовательском центре по охране здоровья матери и ребенка Министерства здравоохранения СССР в лаборатории раннего эмбриогенеза, руководимой проф. Б. В. Леоновым.  

Внедрению в практическую медицину методов воздействия на репродуктивные процессы человека предшествовали многочисленные экспериментальные и клинические исследования, разработка и совершенствование технических средств, методов культивирования ооцитов, оплодотворения in vitro и имплантации эмбриона в матку. Искусственное оплодотворение in vitro и ТЭ предусматривают вмешательства на самых ранних стадиях зарождения человеческой жизни, что делает данную проблему не только медицинской, но и государственной. В связи с этим обсуждаются морально-этические аспекты (социальные, религиозные и др.) искусственного оплодотворения, а также роль врача не только как исследователя и клинициста, но и как гражданина.

В некоторых странах появились сообщения специалистов, обсуждающих как чисто исследовательские возможности, так и этические, моральные и юридические аспекты факта использования техники подсадки оплодотворенной вне организма яйцеклетки женщине. В частности, обсуждается вопрос о том, когда, с какого момента развития эмбрион следует рассматривать как самостоятельное существо и поэтому запретить использование его в экспериментах. В ряде стран церковь и общество оказывают определенное давление на специалистов, работающих в этой области, причем в такой мере, что последние опасаются за возможность продолжать исследования, связанные с применением техники оплодотворения in vitro ооцитов не только человека, но и млекопитающих, и борются за «право на жизнь» таких исследований в стране.

Различают абсолютные и относительные показания к ЭО и ТЭ. Абсолютным показанием является трубное бесплодие вслед- стие непроходимости или отсутствия маточных труб. Относительные показания: 1) предшествующие пластические операции на трубах, особенно если возраст женщин превышает 30 лет, а после операции прошло не менее 1 года; 2) безуспешный сальпинголи- зис или овариолизис, как правило, у женщин старше 35 лет; 3) некоторые формы эндометриоза; 4) бесплодие неясного гене- за; 5) мужское бесплодие; 6) иммунологическое бесплодие у женщин при постоянно высоком уровне антиспермальных антител в течение 1 года [Campagnolic С. et al., 1985]. Абсолютным противопоказанием к ЭО являются возраст женщины старше 40 лет и наличие мужского бесплодия с выраженными патологическими изменениями спермограммы. Существуют и генетические критерии отбора для оплодотворения in vitro. Оно не рекомендуется при гипоспадии, врожденных пороках сердца, при шизофрении, аффективном психозе, множественном склерозе, при наличии в семье детей с аутосомно-рецессивными заболеваниями, риск повторного наследования которых составляет 25 %. Противопоказаниями являются также доминантно-наследуемые болезни [Buhler Е., 1985].

Все супружеские пары, отобранные для лечения по методу ЭО и ТЭ, должны понимать его суть и быть готовыми к сотрудничеству с врачами, знать о возможном риске и дать продуманное согласие на лечение. Необходима и психологическая подготовка больных к ЭО.

Ввиду того что существует достаточно высокая вероятность неудачи, следует четко объяснить это больным, желающим лечиться этим методом. Требуется время для подготовки супругов к «реальному лечению», так как оно в действительности часто представляет для них последний шанс иметь собственного ребенка. Такие больные приходят к идее «лабораторного зачатия» с большой надеждой, смешанной со страхом неудачи. Неудача на любом этапе лечения по методу ЭО и ТЭ может восприниматься очень тяжело, несмотря на их прежние уверения в том, что они четко понимают, насколько малы шансы на успех. Поэтому необходимо оказывать им внимание и поддержку до, во время и в течение некоторого времени после каждого цикла лечения. Наилучший результат, который может быть достигнут в этой ситуации, — это дать им возможность чувствовать себя соучастниками работы и вместе разделить как радость в случае достижения успеха, так и разочарование в случае неудачи.

За 2 или 3 мес до начала активного лечения по методу ЭО и ТЭ следует произвести полное исследование спермы, включающее бактериологическое исследование и посев, одновременно с исследованием мазков из влагалища и цервикального канала с целью исключения гонококков, микоплазм, грибов, трихомонад, хлами- дий, вирусов и других возбудителей. Лечение инфекционных заболеваний половых органов предпринимается с целью предупреждения заражения культуры, в которой производится оплодотворение, и осложнений после переноса эмбриона. Помимо этого, рекомендуется провести обследование для исключения рака шейки матки.

Во время менструального цикла, предшествующего циклу, в котором производится изъятие яйцеклетки, определяется длительность фолликулярной фазы. В тех случаях, когда у женщин наблюдаются регулярные менструальные циклы, выборочное исследование цервикальной слизи начинают на 9-й день цикла; после того как ее секреция начнет возрастать, определяют содержание эстрогенов и ЛГ в плазме крови для установления времени появления и амплитуды предовуляторного пика.

Далее для подтверждения овуляции определяют содержание эстрогенов и прогестерона в середине лютеиновой фазы менструального цикла. При выявлении ановуляторного менструального цикла рассматривается вопрос о проведении еще одного цикла исследования.

Во время предовуляторной фазы исследуемого цикла берут кровь для приготовления эмбриокультуры и проводят серологические исследования на токсоплазмоз, краснуху, цитомегалови- русы, вирусы герпеса, гепатита-3 и сифилиса. Исследуют также кровь на хромосомы для идентификации лиц с повышенным риском воспроизводства анэуплоидных гамет, а сыворотку крови — на выявление спермантител и антител к блестящей оболочке яйцеклетки.

Существует множество схем проведения стимуляции овуляции (суперовуляции) в целях оплодотворения in vitro. К ним относится применение кломифена, МГЧ (менопаузального гона- дотропина человека) и ХГ, одного МГЧ, ФСГ и МГЧ, одного кломифена. Кломифен назначают по 100 мг на 2-й день цикла в течение 5 дней, МГЧ при этой схеме лечения вводят по 225 ME на 5-й, 7-й и 9-й дни цикла. ХГ в дозе 5000 ME вводят при диаметре фолликула не менее 19 мм. При всех схемах стимуляции овуляции с 7-го дня проводят мониторное наблюдение, включающее определение уровня Е2 в плазме крови, УЗ-иссле- дование и оценку цервикальной слизи. Введение МГЧ прекращают при уровне Е2, превышающем 300 пг/мл, диаметре фолликула 14 мм и более. ХГ назначают через 48 ч после прекращения введения МГЧ [Giacomini P. et al., 1986]. Максимальная частота наступления беременности отмечена при стимуляции овуляции кломифеном и МГЧ и наименьшая — при стимуляции только кломифеном. Между количеством фолликулов, ооцитов, процентом оплодотворенных ооцитов и дозой гонадотропина выявлена прямая зависимость. Однако на частоту наступления беременности доза гонадотропинов заметно не влияла. В большей степени частота наступления беременности зависела от достижения максимального уровня ЛГ при стимуляции овуляции. Для успешного ЭО рекомендуют проводить мониторный контроль роста и развития фолликулов с помощью УЗИ, а также определять уровни Е2, прогестерона и ЛГ; выявлять индивидуальный ответ на стимуляцию.

Стимуляцию овуляции следует прекращать, если максимальный уровень ЛГ выявляется до овуляции, размер доминантного фолликула не менее 21 см; если уровень прогестерона возрастает без повышения уровней ЛГ, количество фолликулов менее 6; если максимум ЛГ имеет место при наличии более 5 фолликулов; если доминантные фолликулы размером более 21 мм появляются до максимального содержания прогестерона [Kemeter P., Feichtin- ger W., 1985].

Если вышеизложенные схемы стимуляции овуляции хорошо выдерживаются, то могут быть получены зрелые яйцеклетки или яйцеклетки, проходящие стадию мейотического созревания без каких-либо осложнений, которые иногда возникают при аспирации увеличенных фолликулов через 32—38 ч после введения ХГ.

Некоторые авторы отказываются от этих методов стимуляции яичников, так как часто после назначения МГЧ/ХГ или ФСГ/ХГ лютеиновая фаза имела неадекватную продолжительность или возникала гиперстимуляция, в результате чего яичники становились большими васкуляризованными, содержали несколько фолликулов с большим количеством жидкости и высоким уровнем Ег и прогестерона [I. Steptol et al., 1979]. Полагают, что концентрация стероидов в фолликулярной жидкости гиперстимулиро- ванных фолликулов значительно отличается от тех, которые наблюдаются при естественном менструальном цикле. Это может быть причиной неудач при беременностях, которые вызваны переносом эмбриона, развившегося из полученной при стимуляции яичников яйцеклетки. Существует точка зрения, что яйцеклетки, подлежащие последующему ЭО, следует аспирировать в течение естественного менструального цикла, без стимуляции. Забор яйцеклетки производится при лапароскопии, реже при лапарото- мии во время операции на трубах [Грищенко В. И. и др., 1986].

Премедикацию и общую анестезию проводят так же, как и при обычной, обзорной лапароскопии.

В брюшную полость вводят газовую смесь, содержащую 5 % углекислого газа, 5 % кислорода и 90 % азота. Эту же смесь используют в качестве газовой фазы при оплодотворении in vitro и в эмбриокультуре. Чистый углекислый газ, обычно используемый при лапароскопии, не следует применять, так как он может вызывать повреждения созревающей яйцеклетки.

Аспирацию предовуляторного фолликула производят длинной иглой (24 см), изогнутой под углом 45°, с наружным диаметром 1,3 мм и просветом 1,1 мм. Иглу вводят через канюлю, введенную в брюшную полость в точку, расположенную на средине между пупком и лонным сочленением по белой линии живота.

В последнее время появились сообщения об использовании трансвагинальной или трансвезикальной пункции фолликулов под контролем ультразвука [Леонов Б. В. и др., 1987; Cohen J. et al., 1986; Dellenbach P. et al., 1986]. Этот метод упрощает получение ооцитов, снижает риск для пациентки, удобен даже при наличии спаек, его можно применять амбулаторно. Трансвагинальный путь получения ооцитов под контролем УЗИ является перспективным и экономичным, осложнений при этом не зарегистрировано [Dehaene J. et al., 1986]. Данный метод постепенно вытесняет использование лапароскопии для забора яйцеклетки.

Предовуляторная яйцеклетка человека может быть обнаружена невооруженным глазом по наличию в аспирате массивных и клейких хлопьев размером до 5 мм и более. Идентификация взятой яйцеклетки проводится с помощью микроскопии аспи- рированной фолликулярной жидкости, помещенной в чашку Петри. Сперму, предназначенную для оплодотворения, промывают и центрифугируют для удаления семенной плазмы. Сперматозоиды суспендируют в специальной синтетической среде. При проведении осеменения на 1 яйцеклетку добавляют сперматозоиды в количестве 200000—300000 [Wramsby Н. et al., 1984].

Яйцеклетку дважды отмывают оплодотворяющей средой, которая удаляет большую часть фолликулярной жидкости. Затем ее переносят в капле равновесной оплодотворяющей среды под стерильное парафиновое масло. В качестве оплодотворяющей среды применяют раствор Тироде, содержащий пируват, альбумин и антибиотики.

В связи с тем что эмбрион в большинстве случаев переносится в полость матки на стадии 8 или 6 клеток, это означает, что эмбрион человека перед имплантацией должен содержаться в культуре в течение 2—3 сут.

L. Pilska и соавт. (1984) сообщили об опыте оплодотворения в маточных трубах у 49 женщин. Они осуществляли перенос зрелой яйцеклетки и отмытых сперматозоидов в просвет яйцевода в конце операции на маточных трубах. Беременность наступила у 6 женщин; из них одна была внематочная, 3 — закончились спонтанным абортом, 2 — родами жизнеспособными плодами.