НИТРИФИКАЦИЯ

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

ВЛИЯНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ НИТРИФИЦИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Опыты, описанные в настоящей статье, касаются деятельности обоих микробов — возбудителей нитрификации — и соответственно разделяются на две группы. Мы начнем с нитратного микроба, потому что таков был порядок нашей работы. Поэтому данный микроб был изучен более обстоятельно в интересующем нас направлении, в то время как вторая группа опытов, посвященная изучению нитритного микроба, является не более чем сжатым повторением первой и осуществлялась по той же самой программе.

ОПЫТЫ С НИТРАТНЫМ МИКРОБОМ

Нитратный микроб легко поддерживается в деятельном состоянии на нйтритном агаре. Эта среда и ее применение описаны в другой работе.   

Мы располагали культурами различного происхождения. Одни из них были получены из образца немецкой почвы (Нортхейм), которым мы обязаны любезности профессора Штуцера (Stntzer) из Бонна, другие — из петербургской почвы. Оба штамма ничем не отличались один от другого.

Методика, примененная нами, весьма несложна. Мы заражали чистой культурой нитратного микроба минеральный раствор, содержащий соль азотистой кислоты, и параллельно такой же раствор, но с добавлением различных количеств исследуемых органических веществ. По истечении инкубационного периода ежедневно, в один и тот же час, производилась проба при помощи реактива Троммсдорфа, для чего платиновым ушком отбиралась небольшая капелька раствора. После исчезновения нитрита жидкость испытывалась с раствором дифениламина в серной кислоте. Работая всегда строго одинаковыми приемами, можно даже судить остепени интенсивности реакции по интенсивности окрашивания.

Контрольные культуры указывали время, необходимое для окисления определенного количества нитрита в так называемой «нормальной» среде. Если прибавление органического вещества не замедляло течения процесса, то отсюда вытекало, что оно в данном количестве не оказывало никакого эффекта. Если же его присутствие вызывало замедление, то делался вывод о его угнетающем действии. Степень этого вредного влияния была тем выше, чем продолжительнее замедление или меньше доза. Наконец, определялось минимальное количество вещества, полностью парализующее процесс окисления нитритов.

Следует отметить, что эти опыты, несмотря на их кажущуюся простоту, требуют большой тщательности. Необходим точный контроль за количеством и качеством посевного материала, а также приходится учитывать особенности его «в о с п и т а н и я», о чем будет сказано ниже.

Чтобы избежать, по возможности, погрешностей, мы не допускали широких сравнений между различными сериями опытов. Например, "работа значительно упростилась бы, если бы можно было раз навсегда установить время окисления определенного количества нитрита в «нормальной» среде и пользоваться этой величиной как основным материалом для сравнения. Однако в нашем случае это исключалось. Мы были вынуждены идти по пути увеличения количества контрольных культур в каждом опыте. Лишь изредка, когда речь шла только о подтверждении какого-либо результата, заранее предвиденного, мы довольствовались одним контролем.

Материал для посева приготовлялся следующим образом: из культур на косом нитритном агаре вырезались штрихи и переносились в колбочки, содержащие 15—20 мл воды; после тщательного взбалтывания содержимое вносилось пипеткой в сосуды для культуры микроба. Слабым посевом мы будем называть посев одним ушком, взятым из взвеси одного штриха в вышеуказанном объеме воды, средним посевом — три ушка из взвеси двух штрихов; наконец, в некоторых случаях, культуры сразу населялись большим количеством микробов, для чего использовалась дюжина штрихов, и посев производился одним миллилитром взвеси.

Удачными считались лишь те опыты, в которых во всех контрольных колбах, либо в большинстве из них, образование нитратов завершалось одновременно или по крайней мере с промежутком в 1—2 дня. Таким образом, понятие «нормального» срока процесса определено вполне отчетливо, а влияние органических веществ проявляется достаточно наглядно.

Состав нашей «нормальной>> среды был таков:

Нитрита натрия (Na nitros. puriss. Merck)            *                      1,0 г

Фосфорнокислого калия                 0,5 »

Сернокислого магния          -                      0,3 »

Углекислого натрия (кальцинированного)                      0,5 »

Хлористого натрия              0,5 »

Дистиллированной воды, дважды перегнанной с перманга- натом    1000 мл

Впоследствии мы увеличили содержание кальцинированной соды до 1 г на литр; позднее мы стали прибавлять одну из солей железа. В протоколах наших опытов мы обозначали «соды 0,05%», когда употребляли первоначальный раствор, и «соды 0,1% + FeS04», когда применяли раствор измененный.

Говоря о причинах изменений чувствительности, мы упомянули о влиянии культуры, предшествующей опыту, другими словами, о «воспитании микроба», применяя выражение Дюкло. Казалось вполне вероятным, что материал, выращенный на чисто минеральной среде, чувствительнее к небольшим дозам органического вещества, чем культивированный на нитритном агаре. Действительно, эти предположения оправдались в ходе опытов.

Для краткости изложения мы будем придерживаться следующего порядка: сначала ставится вопрос и непосредственно за ним приводится протокол опыта, который должен дать ответ. Затем, отметив результаты, мы переходим к следующему вопросу и т. д. Общее обсуждение и заключения будут приведены в конце статьи.

Культуры велись в конических колбах с плоским дном, диаметром в 10—12 см при 30 и 35°. В нижеприводимых таблицах, отражающих течение опытов, знак 4- означает максимальную нитритную реакцию, 0 — ее отсутствие; многоточие означает «и так далее»,- т. е. что последующие ежедневные анализы приводили к тем же самым результатам. В последнем столбце указана продолжительность течения процесса в днях, причем знак + показывает, что нитритная реакция оставалась заметной до конца опыта.

I. Предварительные опыты в минеральном растворе

Каково оптимальное количество соды и можно ли исключить ее из среды или уменьшить ее дозу, не вызывая торможения процесса?

Опыт 1. В шесть небольших конических колбочек внесено но 20 мл минерального раствора с нитритом, но без соды. Три из них были защищены от соприкосновения с углекислотой воздуха: по окончании стерилизации их охлаждали в эксикаторе над едким натром, откуда извлекали только для посева, после чего снова помещали в эксикатор, сообщавшийся с внешним воздухом через промывную склянку с едким натром.

Результат: никакого окисления по истечении 30 дней.

Таким образом, очевидно, что углекислая соль необходима. Опыт повторен со следующими изменениями:

Опыт 2. В восемь больших конических колб внесено по 50 мл минерального раствора без соды. Две колбы так и оставались без соды, ав каждые две следующие колбы прибавлялись постепенно возрастающие количества кальцинированной соды

Мы видим, что количества, превышающие 0,1%, не оказали сколько- нибудь заметного эффекта. Ввиду необходимости в опытах с органическими веществами избегать сильной щелочности среды, мы. остановились на 0,1% соды.

Так как при окислении нитрита свободной кислоты не образуется, роль карбоната нельзя объяснить исключительно нейтрализацией кислоты, В этом случае щелочной монокарбонат был бы равноценен бикарбонату. Между тем из последующего опыта видно, что это не так.

Опыт 4. В семь небольших конических колб внесено по 20 мл раствора соды концентрации 0,1%. Три из них были тщательно изолированы от углекислоты воздуха, как это описано в опыте 1, а остальные четыре помещены в том же термостате без всяких предосторожностей

Колбочки, извлеченные из эксикатора по истечении месяца, показали ту же интенсивность нитритной реакции, что и в начале опыта. Затем в каждую из них было добавлено немного углекислоты и они были оставлены на воздухе ().

Очевидно, дело не только в щелочной реакции среды, так как мы видим из этого опыта, что исключение свободной углекислоты из среды, содержащей щелочной монокарбонат, полностью остановило окисление. Однако микроб не был убит, и после внесения в жидкость углекислоты он медленно возобновил свою деятельность.

После работы одного из нас1 трудно сомневаться, что именно характер углеродного питания микроба делает возможным его культуру только в щелочном растворе, поглощающем углекислоту из воздуха, или же в присутствии щелочных либо щелочноземельных бикарбонатов.

Тогда мы попробовали прибавлять небольшое количество углекислоты в каждый сосуд непосредственно после его стерилизации и охлаждения. Иногда это давало положительный эффект, но в большинстве случаев воздух термостата, в котором выращивались культуры, содержал достаточное количество углекислоты, так что в дополнительном ее прибавлении не было надобности2.

Опыт 5. В 4 колбы было внесено по 50 мг жидкости, содержащей 0,1% соды. В две из них прибавлена углекислота, после чего колбы подверглись тщательному взбалтыванию. Углекислота, оставшаяся непоглощенной, была удалена. Для двух других колб источником углекислоты служил воздух термостата ().

Опыт подтвердил сказанное нами выше.

Три последних опыта этой части нашей работы были посвящены влиянию солей железа на ход окисления.

Опыты 6, 7, 8. Каждый из сосудов содержал по 50 мл обычного раствора (копцен, трация соды 0,1%). К одной части было прибавлено закисное сернокислое железо- окисляющееся во время стерилизации и образующее легкий осадок на дне сосудов.

Два первых опыта'оказались неудачными; тем не менее в них проявилось благоприятное действие соли железа, некоторый избыток которого (0,04%) содействует окислению.

Нижеследующий опыт был поставлен для опровержения возражения,- согласно которому наблюдавшийся эффект не является результатом биологического процесса, но вызван чисто химическим действием добавленной соли.

В шесть плоскодонных колб было внесено по 25 мл минерального раствора, содержавшего 0,1% соды. В три из них прибавлено 0,04% закисного сернокислого железа. Все колбы стерилизовались ири 120° и без заражения выдерживались в термостате при 35° в течение двух недель. 2 мл раствора перманганата, к которым при определении всегда прибавлялось 10 мл дистиллированной воды и 20 капель серной кислоты, обесцвечивались следующими количествами раствора нитрита

Мы должны были ограничиться приведенными выше опытами, целью которых было установление оптимального состава нашей «контрольной» ci

Опыты по влиянию органических веществ и аммиака на процесс окисления и на развитие микроба

Мы начали с изучения влияния пептона и глюкозы на чистую культуру нитратного микроба.

Опыт 9. Было взято 16 колб, содержавших по 50 мл нитритного раствора (концентрация соды 0,05%). Четыре колбы были оставлены для контроля, к шести был прибавлен пептон и к шести глюкоза

15 ноября в сосуде с 2,4% глюкозы был замечен небольшой островок плесени и через 5 дней она затянула всю поверхность жидкости. Нитритная реакция исчезла, но нитраты не были обнаружены. Эту культуру мы не принимаем в расчет. Островок плесени был обнаружен также в сосуде с 1,6% пептона. Нитриты в нем исчезли на 24-й день, но дифениламин в этом случае показал присутствие нитратов.

Лишь в двух культурах, получивших добавку органических веществ, окисление дошло до конца (см. культуры с 0,1 и 0,4% пептона). Во всех остальных по прошествии 45 дней интенсивность нитритной реакции оказалась той же, что и в начале опыта.

Таким образом, даже самая слабая доза глюкозы из взятых нами в данном опыте (0,2%) совершенно подавила процесс окисления. Что же касается пептона, то количество его, равное 0,1%, не оказало никакого действия; более высокие концентрации подавляли окисление, однако нельзя было подметить зависимости между количеством пептона и его тормозящим действием, так как в большинстве колб реакция не пошла совсем. По прошествии 45 дней опыт был прекращен. Полученные культуры были использованы для контрольных опытов, поставленных для разрешения следующих вопросов: 1) действительно ли чисты культуры, оставшиеся по всем видимым признакам чистыми; 2) произошло ли развитие нитратного микроба в тех культурах, где окисление нитритов не было обнаружено.

1.         Был произведен посев на мясопептонный бульон несколькими каплями культуральной- жидкости из каждого сосуда (за исключением двух заведомо засоренных культур). В результате все пробирки оставались стерильными неопределенно долгое время.

2.         Маленькие плоскодонные колбочки, содержавшие по 5 мл обыкновенного нитритного раствора, заражались каждая тремя каплями жидкости из культур с 0,2 и 1,6% глюкозы и 0,2, 0,4, 0,8 и 1,2% пептона.

В результате только в пассаже из культур с концентрацией пептона в 0,1 и 0,4% произошло нормальное окисление. В остальных процесс не развивался. Подобные же отрицательные результаты показал посев на нитритном агаре. Рост был отмечен лишь в пассажах, сделанных из культур, в которых произошло образование нитратов.

В опытах подобного рода необходимо различать влияние этих веществ на молодые, развивающиеся клетки и на взрослые особи. Можно предположить, что при введении в нитритный раствор большого количества микроорганизмов, они реагируют на присутствие органического вещества иначе, чем при посеве ничтожно малым количеством. Итак, если известные органические вещества задерживают процесс окисления, останавливая размножение микроба, сохранят ли они это влияние при внесении их в среду с большим количеством организмов?

Опыт 10. Было взято 18 колб, содержавших но 25 мл нитритного раствора (концентрация соды 0,05%) без добавок или с прибавлением показанных в табл. 8 количеств органических веществ. Мочевина была стерилизована сухим жаром при 1J0 и прибавлена к раствору после стерилизации. Растворы пептона и глюкозы также стерилизовались отдельно и вносились в колбы градуированными пипетками. Для приготовления посевного материала штрихи из 15 пробирок с питритным агаром были разболтаны с 20 мл жидкости; из полученной мутной взвеси бралось при сильном взоал- тываннн по 1 мл для посева в каждую колбу.

Культуры остались прозрачными, за исключением содержавшей 0,1% глюкозы, где был замечен маленький островок плесени. Нитритиая реакция исчезла из этой 'холбы на 34-й день; к этому времени в ней было восемь островков плесени средней величины. Однако нитратная реакция оказалась очень интенсивной. Сыграла ли плесень какую-либо роль в конечном результате, а если сыграла, то какую?

Таким образом, видно, что при очень богатом посеве пептон в концентрации, не превышающей 0,2%, и мочевина в концентрации не выше 0,4% не только не задерживают окисления, но скорее благоприятствуют ему.

Глюкоза, напротив, проявляет свое подавляющее действие уже при концентрации 0,05%; 0,2% глюкозы полностью останавливает окисление; 0,05% аспарагина дает такой же эффект, однако на этот раз не возрастающий параллельно с увеличением концентрации. Неожиданным оказалось то, что контрольные колбы не реагировали на столь обильный посев: в большинстве случаев окисление окончилось на 8—10-й день, как и при обычном посеве; в одной колбе процесс завершился даже со значительным опозданием.

Мы повторили еще раз опыты с пептоном и мочевиной, значительно уменьшив на этот раз количество посевного материала.

Опыт 11. Было взято 11 колб по 50 мл нитритного раствора в каждой (концентрация соды 0,1%). Мочевина стерилизовалась сухим жаром при 110 ; раствор пептона также стерилизовался отдельно. Оба вещества вносились в концентрациях, указанных в табл. 9.

Посев средний.

При сравнении этой таблицы с табл. 8 опыта 10 видно, что положительное влияние пептона едва ощутимо. Что же касается мочевины, то она проявила тормозящее действие, слабое при невысоких концентрациях, но возрастающее по мере их увеличения.

Итак, пептон в концентрации, не превышающей 0,2%, не оказывает никакого влияния на окисление. Мы попытались увеличить дозу.

Опыт 12. В десять колб было внесено по 50 мл нитритного раствора (концентрация соды 0,1%). Шесть колб оставлено в качестве контролей. В четыре колбы перед стерилизацией был внесен пептон. Посев — умеренным количеством посевного материала

Концентрации пептона 0,2 и 0,4% не оказывают влияния, но более высокие дозы явственно замедляют процесс. На табл. 10 мы видим, что линия, соединяющая нули («кривая нулей»), отклоняется вправо и вниз от вертикали. Правда, падение ее еще довольно крутое, но она все же показывает чувствительность микроба к увеличению концентрации.

1 % пептона переносится микробами еще довольно легко, однако можно предположить, что более высокие концентрации вызовут сильное торможение процесса.

Опыт 13. Было взято шесть колб с теми же количествами жидкости. Одна из них оставлена в качестве контроля.

Посев — минимальным количеством посевного материала ().

Четыре последние колбы выдерживались в термостате в течение трех месяца, По ослабления нитритной реакции не наблюдалось.

На этот раз 1 % пептона задержал окисление на 12 дней, более высокие концентрации совершенно затормозили процесс.

По окончании 13-го опыта содержание всех сосудов исследовалось под микроскопом и при помощи контрольных посевов.

Микроскопическое исследование. В двух первых культурах (контрольной и с 1 % пептона) нитратный микроб был най,|ен в обычных количествах. В четырех последних культурах микробы не были обнаружены.

контрольные посевы. 1) Из каждой колбы 13-го опыта взято по три капли для заражения шести пробирок с бульоном. Пробирки остались стерильными. 2) Таким же образом было засеяно шесть колб, содержавших по 50 мл обычного нитритного раствора. В результате только в двух из них, происходивших от контрольной культуры и от культуры с 0,1% пептона, окисление окончилось за 8 дней. В четырех остальных окисления не произошло.

По прошествии нескольких месяцев все среды, содержавшие пептон, остались неизменными. В течение всего опыта в них нельзя было обнаружить никаких следов роста бактерий, так же как и присутствия аммиака.

Из этих фактов нельзя не сделать вывода, что окисление нитрита и рост микробов— явления, не отделимые одно от другого. Столь излюбленное многими микробами вещество, как пептон, осталось совершенно неиспользованным; добавление пептона не оказало никакого действия на специфическую функцию нашего организма, если не считать ее замедления или полного торможения.

Вернемся к глюкозе — веществу, оказавшему самое неблагоприятное влияние. Однако на этот раз были испытаны более слабые концентрации. Для опыта параллельно был взят глицерин.

Опыт 14. Было взято 12 колб по 50 мл обычного раствора в каждой (концентрация соды 0,1%). Посев — умеренным количеством посевного материала (табл. 12).

Как видно из табл. 12, действие глюкозы чрезвычайно сильно и замет* но возрастает с увеличением дозы. Кривая нулей показывает большую чувствительность микроба к возрастанию концентрации. Действие глицерина несколько иное; оно отчетливо заметно уже при малых дозах, но не усиливается с возрастанием концентрации.

Опыт был повторен. Это оказалось тем более необходимым, чта. контрольные культуры в нем работали плохо.

Опыт 15. Было взято 10 колб, из которых две служили для контроля, а остальные использовались так же, как в 14-м опыте

Чтобы получить более полное представление о действии глюкозы, мочевины, аспарагина и глицерина, был проведен еще один опыт, целью которого явилось, с одной стороны, сравнение действия минимальных доз этих веществ, а с другой — установление их предельных концентраций (т. е. полностью парализующих процесс).

Опыт 16. Были взяты 22 колбы по 50 мл обычного нитритного раствора в каждой (концентрация соды 0,1%). В ряд колб прибавлено органическое вещество в количествах, указанных в табл. 14.

Опыт длился 50 дней. По истечении этого срока не было отмечено никаких изменений в культурах сглюкозой ив последней культуре с аспарагином.

Мы видим, что концентрация глюкозы в 0,025% не только безвредна, но даже, повидимому, оказывает благоприятное воздействие. Ьолее высокие концентрации, например, 0,3%, являются уже предельными. 0,05%мочевины не оказывают никакого влияния, концентрации 0,5 и 0,8% вызывают соответствующее замедление, однако кривая нулей падает при этом довольно круто, так что предельная доза, вероятно, еще далека.

Задерживающее влияние аспарагина обнаруживается уже при слабых концентрациях, но дальнейшее увеличение дозы не дает заметного эффекта. Возможно, что концентрация в 1 %, полностью парализовавшая процесс; уже выше предельной.

Аналогичный результат получен с глицерином, с тою лишь разницей, что здесь предельная концентрация была выше 1%.

Перейдем к изучению влияния некоторых питательных жидкостей сложного состава: мясного бульона, сенного настоя» опавших листьев, садовой земли, мочевины, т. е. сред, легко доступных нашему микробу в природных условиях.

Опыт 17. Водные настои сена, опавших листьев (частично сгнивших) и садовой эемли выдерживались 5—6 часов в термостате при 35°, затем нагревались до кипения, отфильтровывались, нейтрализовались и стерилизовались. Определенные количества этих настоев, указанные в табл. 15, вносились в обычные колбы, содержавшие по 50 мл раствора.

В колбе, содержавшей 16 мл сенного настоя, реакция исчезла на 69-й день, но при микроскопическом исследовании эта культура оказалась нечистой: к нитратному микробу была примешана какая-то толстая бацилла.

Настои сена и опавших листьев, повидимому, оказывают благоприятное действие в количествах, не превышающих 8 мл, т. е. 14%. Удвоенное количество сенного настоя очень сильно тормозит процесс. Несмотря на некоторое положительное действие настоев листьев и сена, их кривая нулей отклоняется вправо от вертикали (хотя и довольно круто), что указывает на чувствительность микроба к этим веществам. Настой почвы не дал почти никакого эффекта при всех концентрациях.

Опыт 18. Было взято 12 колб в каждой по 50 мл обычного нитритного раствора чистого или с добавлением некоторых количеств бульона либо человеческой мочи. Посев — минимальным количеством посевного материала

Неожиданным результатом данного опыта было сильное, угнетающее действие мочи: 1 мл ее в пять раз увеличил время, нужное для окисления; 10 мл, казалось, полностью парализовали процесс, однако он все же дошел до конца, для чего потребовался чрезмерно долгий промежуток времени в 90 дней. Этот факт заслуживал повторного изучения, и мы к нему вернемся, покончив с бульоном.

Из опыта 18 видно, что бульон в количестве, не превышающем 4 мл (т. е. 8%), не оказывает никакого влияния, 5 мл уже замедляют процесс. Тогда, вместо изучения влияния более высоких концентраций, мы решили использовать эти бульонные культуры для разрешения следующего вопроса: можно ли приучить микроб к бульонной среде путем последовательной культуры в присутствии все возрастающих концентраций бульона и таким путем заставить его расти в неразбавленном бульоне? Не явится ли следствием подобного приема глубокое изменение функций микроорганизма? Ответом служат опыты 19, 20, 21 и 22. Они представлены рядом последовательных бульонных культур различных концентраций.

Опыт 19. Указанные в табл. 17 количества бульона добавлялись к 50 мл обычного нйтритного раствора.

Посев производился каплей жидкости, взятой из культуры с 5 мЛ бульона из опыта 18.

Сравнив табл. 17 с табл. 16 опыта 18, мы видим, что прибавление 5 мл бульона, вызвавшее замедление процесса в опыте 18, оказывает здесь скорее благоприятное воздействие. Большие количества (до 30%) также почти не вызывают никакого эффекта, хотя кривая нулей показывает некоторую чувствительность к увеличению концентрации.

Опыты 20, 21, 22. В этих опытах бульон смешивается с обычным минеральным раствором, но без нитрита, таким образом, чтобы объем жидкости в каждом сосуде, равнялся 50 мл. Затем в каждую колбу добавлялось по 2,5 мл 2%-ного раствора NaN02. В результате мы имели:

20        мл       бульона + 30  мл            минерального           раствора

30        »          » + 20  »          »          »

40        »          » + 10  »          »          »

50        »          » + 0    »          »          »

Концентрация минеральных солей в колбах была неодинакова, но это не имело существенного значения вследствие обилия питательных солей в мясном бульоне. Материал для посева брался каждый раз из предшествующего опыта из культур с наивысшей концентрацией бульона, в которых образовались нитраты

Сравнивая табл. 18—20, мы видим, что с каждым новым пересевом микроб все более привыкает к высоким дозам. Некоторый успех нами уже был отмечен в опыте 19 после пересева культур из опыта 18. В опыте 20 микроб действовал уже в присутствии 20 мл бульона, хотя и с известным затруднением (процесс длился 24 дня). После следующего пересева, произведенного в тех же условиях, этот срок сократился до 14 дней. В присутствии 25 мл бульона, что равно 50% его концентрации, окисление продолжалось 26 дней; после нового пересева срок сократился до 24 дней.

Продолжая работать в данном направлении, можно было бы добиться еще некоторых успехов. Однако и этих опытов достаточно, чтобы обнаружить факт привыкания. После четырехмесячной культуры наш микроб мог развиваться в среде, наполовину разбавленной бульоном, но на дальнейшее увеличение концентрации он всякий раз реагировал полным прекращением своей жизнедеятельности. Характер роста микроба за это время нисколько не изменился: бульон с нитритом оставался прозрачным и по внешним признакам неизменным; он не издавал никакого запаха, аммиак в нем отсутствовал. Под микроскопом можно было видеть умеренные количества мелких палочек нитратного микроба, с трудом поддававшихся окраске. Бульонные культуры, концентрация которых превышала предельную, оставались абсолютно прозрачными и при микроскопическом исследовании совершенно лишенными микробов.

Вернемся теперь к опытам с мочой, сильное угнетающее влияние которой было нами отмечено в опыте 18.

Требовалось выяснить, какая из составных частей мочи оказывала столь сильное угнетающее действие.

Мы уже видели, что влияние мочевины очень невелико, так что названный эффект нельзя отнести на ее с#ет. Оставалась неизученной мочевая кислота, одна из наиболее постоянных составных частей мочи.

Опыт 23а. Вследствие плохой растворимости мочевой кислоты, готовился ее насыщенный раствор в обычной минеральной среде. Маленькие дозы мочи вносились градуированной пипеткой до стерилизации. Посев — минимальным количеством посевного материала

Из табл. видно, что мочевая кислота не влияет на ход процесса, однако эффект от прибавления мочи в ничтожно малых количествах был очень велик.

Следующий опыт () был сделан с человеческой и с лошадиной мочой.

Опыт 236 ().

Торможение, вызванное добавлением человеческой мочи, на этот раз было не столь значительным, как в предыдущем опыте, но все же существенным.

Лошадиная моча оказывала более сильное действие: 5 мл ее было достаточно для полной остановки окисления — по прошествии трех месяцев нитритная реакция не уменьшилась.

Так как моча всегда содержит небольшое количество аммиака, которое могло еще увеличиться в процессе стерилизации за счет мочевины (напомним, что в предыдущих опытах мочевина всегда стерилизовалась в сухом виде), то возник вопрос, не вызывается ли это действие аммиаком. Ввиду незначительности содержания аммиака в моче, для опыта были взяты слабые дозы аммиака в форме сернокислого аммония.

Опыт 24. Стерильный 1%-ный раствор сернокислого аммония был добавлен к семи колбам (заранее простерилизованным и охлажденным), содержавшим по 50 мл нитритного раствора (концентрация соды 0,1%). Было внесено 0,1; 0,5; 0,8; 1,0; 1,5; 2,0 и 3,0 мл раствора сернокислого аммония, что соответствует количеству аммиака

В большинстве культур аммиачная реакция с реактивом Несслера Остается положительной до конца опыта. Лишь в двух первых культурах, где она с самого начала была едва заметной, она исчезла через несколько недель. В последней колбе она осталась довольно интенсивной по прошествии трех месяцев наблюдений.

Таким образом, угнетающее влияние аммиака становится заметным уже при \ концентрации 5 : 1 ООО ООО. Предельной дозой является 15 : 100 ООО. Следовательно, угнетающее действие мочи можно приписать имеющемуся в ней аммиаку.

Необходимо напомнить, что Уорингтон первый высказал предположение о задерживающем влиянии аммиака на жизнедеятельность нитратного микроба . Этим он объяснял наблюдавшийся многими исследователями факт, что окисление нитрита начинается лишь после окончания первой фазы нитрификации, т. е. после исчезновения аммиака. Взгляды Уорингтона в то время казались мало вероятными; они не могли опираться на какие-либо аналогии и не были подтверждены непосредственными опытами. Такие возражения были высказаны Уорингтону одним из нас 6 лет назад. В настоящее время нужно признать, что Уорингтон был прав— он предугадал истину, окончательно подтвержденную теперь нашими опытами.

Опыт 24 лишний раз подтвердил следующий факт, отмеченный одним из нас и Уорингтоном: нитратный микроб не оказывает ни малейшего действия на аммиак. По окончании окисления нитритов аммиак всегда находился в культурах, несмотря на то, что брались очень малые дозы и что он должен был улетучиваться во время опыта.

Наши опыты уже приближались к концу, когда мы обратили внимание на положительное действие солей железа (см. стр. 216). Следовательно, состав нашего минерального раствора был несовершенен, и контрольные культуры развивались с некоторым замедлением. Тем самым ставились под сомнение опыты, в которых органические вещества оказывали положительное влияние на ход окисления. Так, добавление 0,025% глюкозы и пептона и 2% бульона, казалось, стимулировало процесс. Действительно ли микроб нуждался в небольших количествах органического вещества или же наблюдавшийся эффект зависел от того, что контрольная среда не давала оптимальных условий развития? Последнее предположение подтверждено следующим опытом, в котором низкие концентрации органических веществ не оказали никакого влияния.

Опыт 25. Было взято 16 колб, содержавших по 50 мл минерального раствора с нитритом (0,1% соды, 0,04% FeS04). Все колбы были разделены на четыре группы, состоявшие из равного количества культур. Посев—минимальным количеством посевного материала

Приведем данные еще двух бпытов с уксуснокислым и маслянокислым натрием.

Опыт 26. Было взято восемь колб по 50 мл нитритного раствора в каждой (0,1% соды, 0,04% FeS04). В часть сосудов добавлены соли органических кислот. Посев — минимальным количеством посевного материала ().

Мы видим, что уксуснокислый натрий в концентрациях, не превышающих 1,0%; не оказывает никакого влияния и лишь слабо влияет в концентрации 1,5%. Напротив, микроб очень чуствителен к маслянокислому натрию, замедляющему окисление при 0,5% и останавливающему его при 1 %.

Опыт 27. Отличается от предыдущего лишь концентрацией органических солей

2% уксуснокислой соли замедляют процесс, а 3% совершенно останавливает его. Небольшие концентрации маслянокислой соли оказали лишь незначительное влияние и действовали тем слабее, чем выше была доза (если здесь не вкралась какая-либо ошибка).

При проведении аналогичных опытов с нитритным агаром мы убедились, что те же количества органических веществ производят тот же самый эффект. Если образование нитратов отсутствует, среда остается стерильной.

Подводя итог этим опытам, можно прийти к заключению, что изученные нами вещества непригодны для использования нитратным микробом в качестве источников питания. Микроб переносит лишь слабые дозы этих веществ; их высокие концентрации оказывают совершенно отчетливое угнетающее действие на его размножение и жизнедеятельность. Однако даже самые высокие концентрации лишены бактерицидного действия. Так, микроб выдерживался в 3%-ном растворе глюкозы в течение 1—7 дней, после чего был сделан посев на стандартную среду одной капелькой этого раствора; во всех пересевах отмечался нормальный ход окислепия,

В конические колбы с плоским дном, диаметром в 12 см, наливалось по 50 мл названного раствора, но без аммонийной соли, и прибавлялись одинаковые количества углекислого магния. После стерилизации и охлаждения в каждый сосуд вносилось по 1 мл стерильного 10%-ного раствора сернокислого аммония.

Для посева бралось по 1—2 платиновых петли очень активной культуры. Взятие материала производилось при постоянном взбалтывании. По истечении обычного периода инкубации культуральная жидкость ежедневно испытывалась с реактивом Троммсдорфа до тех пор, пока нитритная реакция не достигала максимума; тогда производились ежедневные пробы с реактивом Несслера до полного исчезновения аммиачной реакции. В приводимых ниже таблицах знак — обозначает отсутствие нитритной реакции, + слабую реакцию, ^максимум нитритной реакции, X заметную реакцию с реактивом Несслера, 0 — исчезновение этой реакции.

Опыт 1. Действие пептона и глюкозы на работу нитритного микроба. Из 12 колб этого опыта четыре служили для контроля, в четыре был прибавлен пептон, и в че- ТЫре — глюкоза, что отражено в табл. 27.

В этом опыте явно обнаруживается большая чувствительность нитритного микроба к весьма слабым дозам пептона и глюкозы. Добавления 0,025 — 0,05% этих веществ уже достаточно, чтобы задержать процесс на 9—15 дней, 0,1 % вызвала задержку более чем на месяц; в присутствии 0,2% этих веществ окисления не происходит.

Опыт 2. Этот опыт посвящен изучению влияния различных питательных веществ, естественных жидкостей и настоев, а именно: глицерина» аспарагина, уксуснокислого и маслянокислого натрия, мочевины, мочи, бульона и настоя свежего лошадиного навоза. Подробности данного опыта указаны в табл. 28.

Глицерин в концентрациях, применявшихся в опыте, не оказал заметного влияния. Аспарагин, напротив, проявлял угнетающее действие уже в концентрации 0,05%; присутствие 0,3% его мешало нормальному ходу нитрификации. Уксуснокислый и маслянокислый натрий, взятые в сравнительно высоких дозах (0,5—1,5%), обнаружили ясное замедляющее действие, усиливающееся увеличением концентрации. Влияние слабых доз мочевины почти сводилось к нулю, но угнетающее действие мочи было выражено резко. Прибавление 1—2 мл бульона не дало никакого результата, но 5 мл уже довольно явственно задерживали окисление. Что же касается навозного настоя, то в данном опыте он скорее способствовал развитию процесса.

Опыт 3. Было взято шесть конических колб; две служили контролем, к двум добавлялся бульон в количестве 20 и 40%, к двум — настой лошадиного навоза в количестве 24 и 32% (табл. 29).

Угнетающее действие бульона проявилось в этом опыте с большой отчетливостью: 20% его нарушили нормальный ход окисления, 40% совершенно его подавили. Напротив, настой лошадиного навоза и в концентрации 32% сохранил свое слабое стимулирующее действие.

Однако действие это было вызвано не органическими веществами, а солевым составом навозного настоя. Различные количества его были провалены, и зола растворена в обычном минеральном растворе, который затем использовался одновременно с нормальным раствором и растворами навозного настоя.

Опыт 4. Было взято девять колб, из них две контрольных, три — содержавших раствор, с добавлением золы из 10, 20 и 30 мл настоя и 4 — с прибавлением указанных в таблице количеств стерильного настоя. Объем жидкости 50 мл в каждом сосуде (табл. 30).

Опыт 5. Было взято 12 колб: четыре — контрольных, четыре — содержавших минеральный раствор с прибавлением в каждую колбу золы из 2 мл настоя и четыре — с прибавлением по 2 мл навозного настоя. Объем жидкости в каждом сосуде равнялся ЬО мл (табл. 31).

Нам было заранее ясно, что опыты с жидкостью такого неопределенного состава, как конский навоз, не могут дать точных результатов, главным образом, вследствие содержания в настое аммиака, хотя в свежем навозе количество его ничтожно. Мы приводим данные этих опытов лишь потому, что нитритный микроб относится к этой вытяжке в общем так же, как и к другим органическим настоям, т. е. он переносит их только в умеренных количествах, в более же высоких дозах они тормозят его развитие.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ