НИТРИФИКАЦИЯ

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

ИЗУЧЕНИЕ НИТРИФИЦИРУЮЩИХ ОРГАНИЗМОВ

ОБРАЗОВАНИЕ И ОКИСЛЕНИЕ НИТРИТОВ В ПРОЦЕССЕ НИТРИФИКАЦИИ

Агрохимики всегда рассматривали нитрификацию как явление, ведущее, в основном, к образованию нитратов. В природе, равно как и в опытах, имитирующих естественные условия, появление нитритов наблюдалось лишь в виде исключения.

Возникновение новых идей о том, что причиной данного процесса являются живые существа, повлекло за собой многочисленные опыты с жидкими средами, легко доступными микроскопическому контролю. В этих экспериментах было сразу обнаружено резкое изменение характера самого процесса: окисление аммиака шло не до конца, и азотистая кислота появлялась в значительных количествах.

Это явление почти одновременно наблюдалось Уорингтоном  и Шле- зингом и Мюнцем  .

Наиболее длительные и трудоемкие исследования с жидкими средами были проведены Уорингтоном, сделавшим много интересных наблюдений, но не сумевшим прийти к определенным выводам. Вот краткое изложение полученных им результатов: в одних случаях нитрификация заканчивалась образованием нитритов, в других развивались вторичные явления, приводившие к их полному окислению; изредка наблюдалось быстрое превращение аммонийного азота в нитратный, без появления продуктов неполного окисления. Однако способность образовывать нитраты, наблюдавшаяся в начале работы, заметно снижалась в ходе дальнейших опытов на жидких средах и в конце концов сводилась к нулю.

Недостатком этих опытов было то, что не принимались эффективные меры для очищения культуры нитрификатора; более того, к питательным средам добавлялось органическое вещество, так что образование нитритов могло итти за счет восстановления нитратов, а не вследствие окисления аммиака. Такого мнения придерживались Гэйон и Дюпти (Gayon et Dnpetit); в свое время оно казалось вполне обоснованным. Однако дальнейшие работы Уориигтона и Мунро (Munro) показали ошибочность этого взгляда. Так, Мунро  наблюдал образование нитритов в родниковой воде без добавления в нее органических веществ.

Впоследствии этот же автор показал что присутствие нитратов й аммонийном растворе, в котором развивается нитрификация, совершенно не влияет на количество образующего нитрита.

Недавно опубликованные работы Франкланда , Уорийгтона  и мои внесли ясность в этот вопрос. Так как все три исследователя имели дело с очищенными культурами, то вскоре все прежние неясности отпали, уступив место четким результатам. Оказалось, что в процессе нитрификации нитриты не только часто образуются в больших количествах, н о являются почти единственным продуктом чистой культуры или даже культуры, очищенной в достаточной степени.

Отсюда следует, что в ходе изучения нитрифицирующих организмов возник ряд новых сложных вопросов, отодвинувших еще дальше решение проблемы нитрификации. Однако работа с очищенными культурами позволила не только четко поставить перед исследователями вопросы, но и указать средства для их разрешения.

Вполне естественно, что почти все ученые считали ход нитрификации в почве нормальным и поэтому искали причину появления азотистой кислоты в неблагоприятных влияниях, парализующих деятельность микробов. Особенно энергично отстаивали эту точку зрения Шлезинг и Мюнц.

Однако экспериментальные данные не подтвердили этих взглядов.

Подобные же воззрения легли в основу гипотезы, согласно которой длительная культура в жидкой среде коренным образом изменяет природу микроорганизма: его способность образовывать нитраты постепенно уменьшается и в конце концов исчезает.

Наконец, существует еще одно толкование, по которому в образовании азотной кислоты из аммиака принимают участие два организма, постоянно присутствующие в почве. Один из них — нитратный микроб — легко исчезает из наших культур, вследствие чего прекращается образование нитратов.

Первым высказал эту мысль Дюкло . Уорингтон в своих заключительных работах также склонялся ко второй гипотезе, допуская, однако, вероятность первой. Эти две гипотезы являются единственными, заслуживающими углубленного изучения. Предположение о том, что нитраты в почве возникают в результате чисто химических реакций, маловероятно, так как они образуются не только в природных условиях, но и в наших культурах, хотя значительно медленнее, чем нитриты.

В таком состоянии находился рассматриваемый вопрос, когда я снова приступил к нему в октябре 1890 г. Этот раздел моих исследований был уже завершен к моменту появления двух новых работ — Мюнца  и Уорингтона . Критический обзор упомянутых работ будет дан после описания результатов моих последних исследований, о которых я уже сообщил вкратце в записке, представленной Академии Наук на заседании от 13 июля 1891 г.

Так как продукция нитритов становилась все более обильной по мере очищения культуры микроба, то можно было сделать вывод, что образование азотистой кислоты являлось его единственной функцией. Однако, преячде чем прийти к подобному заключению, необходимо было всесторонне изучить данную проблему, ибо подобное предположение неминуемо должно было повлечь за собой целый ряд недоуменных вопросов. Действительно, как объяснить, что организм, обладающий энергетическими возможностями окисления, завершает свое действие образованием более восстановленного химического вещества, чем то, которое образовывалось вначале? Даже если допустить, что он не в состоянии сразу осуществить полное окисление аммиака, нельзя объяснить его полную неспособность окислять азотистую кислоту, в то время как окисление этого соединения могло бы явиться для него дополнительным источником энергии. Правда, в мире микробов известны примеры крайней специализации химического действия; мне самому удалось обнаружить в этой области поразительные явления. Однако случай с нитритным микробом оказался из ряда вон выходящим, тем более, что весь обширный опыт, накопленный агрохимиками, говорит о непосредственном образовании нитратов при окислении аммиака.

Мною был намечен в общих чертах следующий план:

1.         Изучить симптомы кажущегося ослабления окислительной функции в жидкой среде, чтобы убедиться в том, действительно ли существует это явление.

2.         Попытаться найти у так называемых нитритных микроорганизмов какие-либо остатки якобы утерянной ими способности образовывать нитраты. В случае успеха постараться эту способность восстановить специальными приемами.

3.         В то же время продолжать поиски специфического нитратного возбудителя, отличного от нитритного.

Приступая к этой работе, я имел в своем распоряжении образцы почв различных стран мира. Пользуюсь случаем выразить свою благодарность всем ученым, любезно предоставившим их в мое распоряжение. Особую признательность я приношу г. Дюкло, г. Крамер (Cramer) — Цюрих, г. Трейб (Treub) — Бьютенцорг, Ява, г. Кавальканти (Cavalcanti) — Кампинас, Бразилия, за присылку мне многочисленных образцов почв. Образцы были взяты с глубины в 10 см и тщательно запакованы в герметически закупоренные сосуды, защищавшие их от пыли при перевозке. Сосуды вскрывались в лаборатории со всеми обычными предосторожностями.

Я стремился получить эти почвы для сравнительного изучения тарификаторов. Вместо того, чтобы сразу приступить к выделению возбудителей нитрификации из этих земель ранее описанными мною приемами, я решил продлить период предварительной очистки культуры, предоставив возможность свободного роста всем организмам, развивающимся на обычной жидкой среде.

Напоминаю состав этой простой среды:

Дистиллированной воды     1000 мл

Фосфорнокислого калия     1 г

Сернокислого магния          0,5 г

Хлористого кальция Следы

Кроме того в каждую склянку вносился в небольшом избытке углекислый магний, свежепромытый кипящей водой.

Склянки со средой стерилизовались, после стерилизации в каждую из них добавлялось по 2 мл 2%-ного раствора сернокислого аммония, что составляет на 15—20 мл жидкости от 2 до 2,5 °/00.

Нетрудно понять, почему я не спешил с выделением 'интересующих меня организмов из этих земель. Во-первых, все наблюдения над «ослаблением» окислительной способности были сделаны над культурами, засеянными просто свежей землей, и над их дочерними культурами. Надо было придерживаться того же. Во-вторых, попытка выделить один организм шла бы вразрез с гипотезой о наличии двух возбудителей.

Привожу названия местностей, из которых были присланы мои образцы:

Европа

Цюрих Женнвилье Казань )

IT ТТЛ -тттст >РОЗСИЯ

Подолия I

Африка

Ла Регия Руиба Митиджа Тунис

Азия

Бьютенцорг (Ява) Токио (Япония)

Америка

Кампинас (Бразилия) К вит о (Эквадор)

Австралия Мельбурн

Исходными для серии дочерних культур служили культуры, засеянные следами земли из каждого образца. Для всех культур в течение опытов поддерживались, за небольшим исключением, равные и постоянные условия. Культуры выдерживались в термостате при 30°.

Я тщательно наблюдал за ходом нитрификации в этих культурах, начиная с материнских, засеянных землей, кончая седьмой генерацией. Изучение культур проводилось максимально часто, каждый раз одинаковыми приемами. Присутствие аммиака определялось по реактиву Нес- слера, нитриты — по иод-крахмальной пробе; при этом применялись следующие условные обозначения: «максимум интенсивности», «слабая реакция», «нулевая реакция». Для обнаружения азотной кислоты азотистая кислота разрушалась кипячением с избытком хлористого аммония или мочевины, после чего определение велось с раствором дифениламина в серной кислоте; или же в испытуемую жидкость вносились цинковая пыль, несколько капель иодткрахмального клейстера и серной кислоты, после чего смесь подвергалась энергичному взбалтыванию.

Приведу некоторые выдержки из протоколов опытов, чтобы дать о них полное представление.

Материнские культуры оказались не вполне идентичными. Почвы, употреблявшиеся для посева, находились, естественно, в различном состоянии: одни из них были извлечены недавно, другие хранились долгое время в герметически закупоренных склянках; некоторые образцы оказались слишком влажными, другие слишком сухими и т. п. В случае сухих образцов для засева жидкой культуры употреблялось от одного до нескольких граммов почвы, в то время как для засева свежей почвой было достаточно ее следов. Состоянием образцов можно объяснить большие различия в начальной интенсивности процесса в материнских культурах. Например, так называемый период инкубации колебался в отдельных случаях от 3 до 20 дней. Различным было лишь время; потребное для завершения процесса; сущность же его оставалась во всех культурах неизменной.

Процесс обнаруживался по появлению нитритов, количество которых вначале быстро возрастало, а затем шло на убыль вследствие превращения нитритов в нитраты.

Вот несколько примеров. Первый из них представляет собой исключение: в культуре, засеянной землей из Квито, нитрификация полностью завершилась в 7 дней; количество нитритов стало уменьшаться, еще не достигнув максимума интенсивности реакции; по истечении недели нитриты исчезли совершенно. Эта почва отличалась энергичным образованием нитратов. В культурах, засеянных другими почвами, тот же процесс занял от 3 недель до 40 дней.

Приводимые ниже два примера являются типичными.

1.         Цюрихская земля. Посев произведен 11 октября в количестве 1 г земли. 22 октября нитритиая реакция достигла своего максимума и исчез аммиак. 29 октября нитритная реакция та же; нитратная реакция почти полностью отсутствует. 1 ноября нитритная реакция выражена несколько слабее. Количество нитритного азота равно 10,2 : 100 ООО.

5 ноября нитратная реакция очень интенсивна.

Из этих примеров видно, что нитрифицирующие организмы, перенесенные непосредственно из естественной среды в легко нитрифицируемую жидкую среду, немедленно образуют значительные количества азотистой кислоты. Процесс четко разделяется на два периода, из которых второй — окисление нитритов — начинается лишь после исчезновения аммиака, причем часто начало его затягивается на много дней. Значительно реже образование и окисление нитритов происходят одновременно, но при этом второй процесс всегда протекает намного медленнее, чем первый.

Перехожу кдочерним культурам.

Для краткости изложения я изобразил дневник моих работ в виде таблицы (табл. 1), в которой Am означает реакпию на аммиак, Ni — реакцию на нитриты. Я обозначил++максимум интенсивной реакции; + слабую реакцию; 0 отсутствие реакции. Например, Am 0, Ni+ + означает: аммиак исчез, превратившись в азотистую кислоту; Am 0,Ni-f- означает, что идет процесс окисления нитритов; Am 0, Ni 0 означает^ что этот процесс закончен и весь азот перешел в форму нитратов. В подобных случаях производилась непосредственная реакция на азотную кислоту, в случаях же, представлявших наибольший интерес, делалось количественное определение.

Необходимо также отметить, что постановка первых культур с землей из Мельбурна, Кампинаса, Квито и их изучение не были произведены одновременно с другими культурами, поэтому их нельзя отнести к одним и тем же числам, хотя исследования осуществлялись в одинаковых условиях.

Результат считался отрицательным, если через два месяца не отмечалось исчезновения нитритов. Для абсолютной уверенности в том, что этот Процесс действительно не развивался, производились количественные определения нитритного азота через каждые 8—10 дней. Продолжать подобные опыты свыше двух месяцев было признано бесполезным.

Прежде чем приступить к обсуждению данных, приведенных- в табл. 1, необходимо отметить следующий факт, не нашедший в ней отражения: к моменту посева первой генерации пяти первых серий нитритная реакция в их материнских культурах достигла максимума, в то время как у шести последних она была или минимальной или отрицательной.

Из табл. 1 ясно видно, что превращение аммиачного азота в нитратный не всегда происходит сразу, но что нитрит является обязательной ступенью при окислении. Таким образом, нет никаких оснований говорить об ослаблении способности микробов к нитрификации. В дальнейшем речь будет итти о наличии или исчезновении специфической способности окислять нитриты.

Конечным итогом всех опытов, за исключением одного, явилось исчезновение этой способности. Однако совершалось оно различным путем. В ряде серий (Цюрих, Женнвилье, Ява, Япония, Мельбурн) это происходило внезапно. В других сериях (JIa Регия, Руиба, Митиджа, Тунис, Кампинас, Квито) окисление нитритов, постепенно ослабевая, шло в целом ряде генераций и, наконец, исчезало (исключением является серия Квито).

Таким образом, уже с самого начала работы обнаруживается заметное различие между тарификаторами, выделенными из различных земель. У европейских, азиатских и австралийских форм способность окислять нитриты быстро исчезает, в то время как у африканских и американских она оказывается более стойкой. Однако в конце концов неблагоприятное влияние культуры в жидкой среде отражается и на них; лишь микробы из земли Квито, с самого начала проявившие себя чрезвычайно энергичными образователями нитратов, сохраняют эту свою функцию.

Таково первое впечатление, которое производят описанные выше факты на наблюдателя. Однако мы постараемся их проанализировать и проверить другими экспериментами, чтобы понять их истинное значение.

Основным моментом является неблагоприятное влияние жидкой среды. В чем же заключается это влияние? Существует оно в действительности или только в нашем воображении?

Чтобы ответить на эти вопросы, необходимо было добиться усиления интенсивности окисления нитритов на этой самой среде и попытаться придать данному процессу более постоянный характер. Мы видели, что он развивается чрезвычайно медленно, но однажды начавшись, идет хорошо. Учитывая это, мы решили устранить длительный период инкубации, взяв для посева материал из культур, в которых было отмечено регулярное образование нитратов. Тем самым мы хотели приблизить ход процесса в культурах к развитию его в почве, где имеет место регулярная продукция нитратов.

В табл. 2 приведены все детали эксперимента подобного рода. Посев культур был произведен 10 октября. Культуры поддерживались до конца января, причем дополнительное количество аммиака вносилось по мере исчезновения не аммиачного азота, а нитритного. Тем самым перед новым пересевом давалось время для завершения окисления.

Этот прием оказался удачным. Из табл. 2 видно, что образование нитратов не уменьшалось, а наоборот, возрастало. В конце опыта, после внесения небольших количеств аммиака, даже не удавалось отметить появление азотистой кислоты, так как весь аммиак превращался в азотную кислоту. Возьмем, например, 21, 24 и 25 ноября. Для обнаружения хотя бы временного появления нитритов в культурах требовалось либо производить анализы через каждый час, либо вносить большее количество аммонийной соли; в последнем случае после каждой новой порции аммиака появлялись значительные количества азотистой кислоты.

Таким образом нам удалось вызвать в нашей жидкой среде процесс, приближающийся к нитрификации в природе. Образование нитратов из аммиака стало регулярным и относительно быстрым, и лишь благодаря легкости наблюдения за ходом процесса в нашем питательном растворе удавалось обнаружить продукты неполного окисления аммиака.

Итак, отрицательного влияния культуры в жидкой среде на эту функцию в действительности не существовало. Решающими оказываются несомненно не химические или физические свойства данной среды, а факторы биологического порядка.

Если изучить по табл. 1 условия, сопровождавшие исчезновение этой функции, можно обнаружить, что она исчезает в новой генерации в том случае, когда в момент взятия посевного материала предшествующая культура содержала большое количество нитритов. Мы уже говорили, что посевной материал для первой генерации пяти первых серий был взят из культур с высоким содержанием нитритов. Напротив, первые генерации шести последних серий происходили непосредственно от культур, в которых шло энергичное образование нитратов; следствием явилось то, что если в первых культурах эта функция у&е исчезла, то во вторых она еще существовала.

В результате посева культур JIa Регия и Руиба (5-я генерация), Тунис (6-я генерация), Кампинас (7-я генерация) материалом, взятым из предыдущих генераций в момент максимального содержания в них нитритов, оказалось, что эти культуры не могли образовать нитратов.

Отсюда можно сделать лишь следующий вывод: непосредственную причину прекращения образования нитратов в жидкой среде надо искать в состоянии материнской культуры в момент взятия посевного материала, состоянии, от которого зависят свойства последнего.

Этот вывод уже несовместим с гипотезой о существовании одного возбудителя нитрификации с двойственными функциями. Наряду с этим он с очевидностью показывает, что нельзя искать причину нитрификации вне деятельности живых организмов.

Оказывают ли нитритные микробы (или, если угодно, микробы, ставшие нитритными) какое-либо окислительное действие на нитриты и можно ли восстановить вновь эту способность специальными приемами?

Прежде всего мне можно было поставить в упрек недостаточную аэрацию культур, так как слой жидкости в сосудах достигал приблизительно 1 см. Для улучшения аэрации следовало распределить равный объем культуральной жидкости по большей поверхности. Это было проделано о двумя культурами, перелитыми в большие кристаллизаторы, снабженные специальными крышками, в которых толщина слоя жидкости не превосходила 1 мм.

Одна из культур, окислившая за 10 дней 420 мг сернокислого аммония, после переливания при прочих равных условиях окислила за 10 дней 1070 мг или 227 мг аммиачного азота, что составляет 22,7 мг в день. Другая культура в тех же условиях дала скачок с 8,5 до 14,6 мг в день.

Однако при столь интенсивной нитрификации количество нитратного азота не возросло, а скорее снизилось, как показали определения.

Итак, усиленная аэрация жидкой среды не благоприятствует окислению аммиачного или нитритного азота в азот нитратный.

Остается выяснить, является ли образующийся нитрит устойчивым или возможно его окисление (хотя бы в незначительной степени) в жидкой среде под влиянием какого-то до сих пор неизвестного фактора.

Для получения ответа на этот вопрос, в культурах, спустя некоторое время после полного исчезновения аммиака, повторно определялось количество нитритного азота за срок от 7 до 20 дней. Определение производилось либо путем титрования 0,01 N раствором перманганата калия нескольких миллилитров жидкости, либо колориметрически с метафенилен- диамином. Иногда для особо точных определений применялись одновременно оба метода, причем бралась средняя величина из двух результатов.

Из табл. 3 видно, что, разумеется, ни в одном случае в культуре, не образующей нитратов, не обнаружено сколько-нибудь значительного окисления нитритов.

Уменьшение количества нитритного азота не превосходит возможной величины ошибки определения. Увеличение, наблюдаемое в отдельных случаях, легко объясняется концентрированием жидкости. Так как полученные мною однородные отрицательные результаты совершенно совпадали с Данными других авторов, и прежде всего Уорингтона, я ограничился приведенными выше опытами.

Имееется еще более простой метод, также дающий вполне точные результаты. Я подвергал нитрификации слабые растворы аммонийных солей в концентрации 1 :100 ООО или 2 :100 ООО. Следы образовавшихся нитритов наблюдались на всем протяжении опытов, длившихся от 6 до 8 недель.

Далее были произведены попытки выяснить, не окажут ли вещества, обычно находящиеся в почве, но отсутствующие в моих растворах, благоприятного влияния на ход этого окисления. Я имел в виду соли Железа и гумус.

Многие ученые полагают, что соли железа могут служить катализаторами при окислительных процессах. В своих предыдущих работах я неоднократно изучал влияние избытка свежеосажденного гидрата окиси железа на культуры микробов и убедился в том, что оно равно нулю. На этот раз я решил испытать двойную железоаммиачную соль (соль Мора). Нитрификация шла нормально, но результаты с интересующей нас точки зрения также были равны нулю.

Культура в стерильной щелочной вытяжке из богатой гумусом почвы в присутствии сернокислого аммония тоже не обнаружила ничего примечательного.

Был осуществлен ряд последовательных опытов со специальной целью — Уяснить, не может ли культура на плотной среде восстановить это якобы утерянное свойство.

В качестве плотных сред применялись:

1)        кремнекислый гель, пропитанный раствором аммонийной соли;

2)        стерильная почва.

На кремнекислом геле культивировались организмы из почв Цюриха, Женнвилье, Явы и Японии. Посев производился ничтожно малым количеством жидкой культуры, наносимой штрихом на поверхность уже затвердевшего геля или вносимой в его толщу перед застыванием. В обоих случаях к°лонии развивались на поверхности и, таким образом, находились в условиях хорошей аэрации. Чашки Петри с этими культурами помещались во влажную камеру, предохранявшую их от высыхания в течение многих месяцев. Время от времени для определения нитритов из чашек извлекалась кусочки геля, величиной с пшеничное зерно, и переносились в маленькие пробирки с реактивом Троммсдорфа. 12 пластинок было засеяно в середине декабря. Опыт длился до мая.

Полученные результаты оказались вполне определенными. Нитритная Реакция появлялась уже через несколько дней, достигала своего максимума через 7—12 дней и оставалась на этом уровне в течение всего дальнейшего времени опыта.

Решающее значение в данном вопросе я придавал своим опытам с почвой, подробно описанным ниже. Ограничусь лишь приведением их общих результатов: в стерильной почве, засеянной чистой культурой нитритного микроба, образуются только нитриты, изменяющиеся также мало, как и в жидких культурах.

Теперь я был окончательно уверен в том, что существовали два различных возбудителя окисления аммиака и нитритов и что окисление нитритов также вызывалось деятельностью микроорганизмов. Я предполагал, что здесь имею дело с некоторой специфической функцией. Изучение видового состава моих культур должно было дать ответ на этот вопрос. Исследованию подверглись серии различного происхождения. С одной стороны, изучались нитритные микробы, биотип которых нам уже был известен, с другой,— нитратные микробы еще неизвестной природы.

Отделение нитритных организмов от некоторых засоряющих форм, встречавшихся в экзотических культурах, не представляло никаких трудностей. Нитритные микробы резко отличались своей округлой формой, размерами, количеством и единообразием от малочисленных и истощенных засоряющих форм, представленных короткими палочками.

Внешний вид их культур не изменялся. Культуральная жидкость большей частью оставалась совершенно прозрачной, но время от времени, не регулярно, в ней можно было отметить кратковременное помутнение, после которого осадок карбонатов на дне становился хлопьевидным, как уже было описано мною ранее.

Местности, расстояние между которыми невелико, содержат, как это можно было предвидеть, почти совершенно одинаковые формы нитритных микроорганизмов. Напротив, у штаммов, происходящих из удаленных одна от другой местностей, даже не разделенных морем, различия в морфологии более заметны. В одних случаях это лишь различия в величине и форме, всегда остающиеся постоянными, в других расхождения выражены более резко, так что, возможно, придется выделить несколько видов или даже родов, в соответствии с общепринятыми принципами классификации. Вопрос этот будет рассмотрен в следующей статье, посвященной изучению морфологии этих организмов.

Есть основание считать уже твердо установленным, что все возбудители нитрификации принадлежат к одному физиологическому типу, общая характеристика которого мною дана выше.

Можно было предположить, что нитратный микроб принадлежит к тому же физиологическому типу, что и нитритный. Однако для полной уверенности следовало изучить данный микроб общепринятыми приемами и методами. Так как эти эксперименты, несмотря на их длительность и разнообразие, оказались безрезультатными, я воздержусь от их описания.

Новый период исследований начинается с того момента, когда для культуры микроба вместо раствора аммонийной соли был применен раствор азотистокислого калия. В ходе предыдущих исследований сложилось впечатление, что присутствие аммиака тормозит образование нитратов, появляющихся лишь после его исчезновения. Независимо от причин этой необычайной чувствительности, было очевидно, что прйме- нение среды с нитритами, в которой невозможно развитие нитритного микроба, позволит успешно осуществить изучение нитратного организма.

Это предположение целиком оправдалось.

Минеральный раствор, содержащий азотистокислый калий в количестве, соответствующем 22 мг азотистой кислоты на каждый культуральный сосуд, был засеян свежей цюрихской почвой и почвой с острова Явы. Через 14 дней в первом сосуде нитрит исчез; во втором его исчезновение произошло позднее. От этих материнских культур были начаты две новые серии «Цюрих» и «Ява», в которых тотчас установился регулярный ход образования нитратов. При самом тщательном микроскопическом анализе в них больше не удавалось обнаружить Nitrosomonas. Для того чтобы в этом окончательно убедиться, был произведен посев одной из культур третьей генерации в обычную среду с аммонийными солями. Ни в одной культуре нитрификация не возникла; по истечении двух месяцев в них не было обнаружено ни нитритов, ни нитратов.

Итак, в отсутствии нитритных микробов процесс окисления аммиака невозмож е.н, так ак нитратные микробы не оказывают на него никакого воздействия.

Отныне имелось полное и неопровержимое доказательство того, что процесс нитрификации складывается из двух отдельных фаз --ни трит- ной и нитратной, причем каждая фаза вызывается особым микроорганизмом. Оставалось лишь выделить возбудителя последней фазы.

Для этого я остановился на серии Квито, в которой этот процесс протекал весьма активно, что подтвердилось следующим опытом.

В пять конических плоскодонных колб вносится по 40 мл среды, представляющей, собой раствор питательных солей и нитрита калия в дистиллированной воде с добавлением небольшого количества углекислого магния. На каждый сосуд приходится по 21,6 мг азотистой кислоты, определяемой титрованием перманганатом. В две колбы А и А' дополнительно вносится по 1 мл сенного настоя, в остальные не добавляется ничего. Четыре колбы засеяны культурой из серии Квито, одна остается незасеянной в качестве контроля.

Если судить по интенсивности процесса, то можно прийти к заключению, что- присутствие органического вещества, близкого по составу к широко распространенному в природе, не оказывает никакого влияния на ход окисления. В то же время этот опыт является наглядным примером активного развития процесса в отсутствие аммиака. Мне легко удалось культивировать этот нитратный организм на твердой среде. В качестве последней был применен кремнекислый гель, для приготовления которого жидкая среда для культуры нитритного микроба упаривалась кипячением до г/3 своего объема и смешивалась с раствором кремневой кислоты в отношении 1:2.

Первые же опыты с этой средой достигли цели, и существование специфического нитратного микроба стало несомненным.

Культуры этого организма в жидкой среде вряд ли могут быть названы культурами в полном смысле этого слова, так как глаз в них не замечает буквально никаких следов роста: жидкость прозрачна, поверхность ее свободна от всяких пленок, хлопьев на дне нет. При обычном микроскопическом изучении жидкости, т. е. при подсушивании отдельных капель с последующей окраской, видно лишь ничтожное количество организмов. Трудно себе представить, что несколько маленьких палочек могут произвести какое-либо заметное действие. В отдельных случаях в препаратах совершенно отсутствовали следы роста, так что данные химического и микробиологического исследования вступали в противоречие: с одной стороны—заметное действие, с другой—очень малое количество организмов.

Наконец, мне удалось их обнаружить. Культивируя микроб в лро- зрачной среде, я заметил, что дно сосудов, в которых размножалась культура, было покрыто слизистым слоем, придававшим стеклу слабый голубоватый оттенок. В стерильных контролях это не наблюдалось. Наклонив сосуд, я поцарапал его дно кончиком только что вытянутого нитевидного капилляра. В просвет капилляра вместе с небольшим количеством жидкости вошли крошечные хлопья. На слизистом слое, покрывавшем дно, можно было различить штрихи там, где его коснулся кончик капилляра. После обычного подсушивания и окрашивания эти хлопья были изучены под микроскопом и оказались состоящими из однородной массы чрезвычайно мелких организмов.

Этот слизистый слой столь плотно прилегает к стенкам, что не удаляется при многократном ополаскивании сосуда большим количеством воды. В старых культурах, возраст которых доходит до 5—6 недель, на дне сосудов хорошо различается покрывающая его прозрачная пленка. При взбалтывании от нее отрываются небольшие кусочки, которые переносятся на покровное стекло, подсушиваются и окрашиваются. Клетки плохо удерживают краску, и применение основных красок дает слабые результаты. Мне удалось добиться хороших препаратов, применяя малахитовую зелень и генциан с последующим окрашиванием фуксином в анилиновой воде; препарат промывают горячей водой, что вызывает обесцвечивание слизистой массы, обволакивающей клетки. На промытом препарате четко вырисовываются контуры клеток.

Фиг. 1 табл. V дает ясное представление об их форме и расположении. На ней изображен кусочек пленки, очертания которой хорошо заметны. Организмы находятся в небольших скоплениях, состоящих из одного слоя мелких клеток. Форма их всегда удлиненная, грушевидная, довольно правильных очертаний; более узкий конец часто загнут в виде клювика. Их средняя длина не превосходит 1 (л, ширина сильно колеблется, в среднем не превышая половины длины.

Один важный вопрос не получил разрешения на основании количественных опытов. Осталось невыясненным, обладает ли этот микроб спо- собностыо ассимилировать углерод из углекислоты в процессе хемосинтеза. Очевидно, что доказать этот факт тем труднее, чем слабее интенсивность процесса. Трудно себе представить более медленный прирост органического вещества, чем у нитратного микроба. Но, несмотря на отсутствие экспериментальных доказательств, можно допустить, что углеродное питание новой группы организмов в основном происходит так же, как и у нитритных микробов, особенно если принять во внимание, что в обоих случаях органическое вещество не оказывает никакого положительного влияния на развитие процессов.

Ферментативная активность этого микроба очень высока. Интенсивность процесса, вызываемого почти неуловимым количеством живого вещества, просто поразительна. Что же касается прироста органического вещества при синтезе, то мы ему отводим последнее место .среди всех живых существ.

Для получения исчерпывающих сведений об обеих фазах нитрификации были поставлены опыты с почвенными культурами.

Целью опытов являлось:

1.         Сравнительное изучение развития микроба в почве и в минеральном растворе;

2.         Сравнение интенсивности процесса образования нитратов в жидкой среде и в почве.

I. Образец цюрихской почвы был распределен в двух больших чашках по 800 г в каждой. Одна чашка подверглась стерилизации, вторая оставлена в первоначальном состоянии. Посев на стерильную почву производился следующим путем: жидкая культура нитритного микроба фильтруется через небольшой тампон из прокаленного асбеста; тампон отмывается до исчезновения нитритной реакции и переносится в ма- .ленькую колбочку с небольшим количеством воды. После энергичного взбалтывания колбочки вода и хлопья асбеста выливаются на поверхность стерильной почвы. Обе порции почвы орошаются 50 мл водного раствора, содержащего 500 мг сернокислого аммония. Через три месяца производится количественное определение нитритного и нитратного азота и воды.

В колбах, засеянных следами почвы, нитратный микроб не развился вследствие слишком незначительного количества посевного материала.

Из этих опытов можно сделать следующие выводы:

1.         В нормальной почве образуются, как это уже давно известно, только нитраты. Нитриты возникают лишь в качестве переходной сдупени. Окисление нитритов ни в коей мере не парализуется даже присутствием значительных количеств аммиака и следует непосредственно за их возникновением. ,

2.         Нет никаких сомнений в том, что чистая культура нитритного микроба образует исключительно нитриты как в почве, так и в жидкой культуре. Однажды возникшие нитриты уже недоступны окислительному воздействию этого микроба.

3.         Нитрит, образовавшийся в почве, не изменяется под действием банальных форм этой естественной среды и остается в том же состоянии, что и в стерильной почве, при условии отсутствия в ней нитратного микроба.

4.         Напротив, если в стерильную почву вводят оба микроорганизма, ход процесса ничем не отличается от его естественного течения; нитрификация завершается без появления нитритов в количествах, превышающих их следы.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ