АЗОТОБАКТЕР

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

ВЫДЕЛЕНИЕ И ЛАБОРАТОРНЫЙ РЕЖИМ

Старый метод, примененный Бейеринком для выделения и культивирования азотобактера, продержался в огромном большинстве лабораторий вплоть до настоящего времени. Но его уже давно пора заменить новым, который позволил бы быстрее продвигать изучение многих вопросов, интересных для морфологии и экологии всей группы этих микроорганизмов, но остававшихся в течение долгих лет неразрешенными.

Как известно, старая методика начинается с заражения почвой безазотистой минеральной среды, в которую прибавлен маннит. Это — накопительная культура. К тому времени, когда в ней появляется азотобактер, здесь уже упрочивается сообщество микробов, наиболее неблагоприятных для его выявления и выделения. С одной стороны, в культуре часто развивается смесь трудно отделимых одна от другой различных рас азотобактера, с другой — в огромных количествах начинают размножаться спороносные возбудители маслянокислого брожения. При таких обстоятельствах нет никакого надежного способа для выделения определенного вида или расы азотобактера из этой смеси; в то же время надо приложить большие усилия, чтобы избежать многочисленных и разнообразных элементов загрязнения.

Параллельно с описанием этой старой методики, сравним ее с методикой, которую мы рекомендуем уже в течение многих лет.

По пластинке из кремнекислого геля, диаметром в 10 или лучше 20 см, приготовленной соответственно нашим указаниям (см. часть шестую, статью IX), раскладывают при помощи стеклянной палочки, вытянутой в волосок и слегка смоченной, мельчайшие частицы почвы, пропущенной сквозь 1-мм сито. Частицы располагают рядами на расстоянии приблизительно 1 см одна от другой. Что касается энергетического вещества, то наиболее целесообразно выбрать этиловый спирт или бензойнокислый натрий или кальций. Дозировка для этилового спирта указана на стр. 698. Бензойнокислого натрия берут 0,5 г на пластинку, диаметром 20 см, и 0,1 г на пластинку, диаметром 10 см.

Колонии азотобактера немедленно появляются вокруг комочков почвы; они развиваются, не сливаясь между собой достаточно долго, так что их можно предварительно систематизировать по характеру их роста, по свойствам выделяемой ими слизи, по пигментации и т. д. Характерный вид этих пластинок дает в этом смысле больше, чем их описание.

Гель начинает буреть вокруг колоний, что характерно для бензойнокислого кальция. При микроскопировании нередко можно обнаружить то в той, то в другой колонии сразу же чистую расу микроба, так как зародыши этого фиксатора азота не слишком часто встречаются в почве. Иногда наблюдается некоторое загрязнение колоний, но оно обычно так незначительно, что для его обнаружения надо выискивать посторонние формы под микроскопом. Загрязнение обычно состоит из маленького кокка и 2—3 форм мельчайших палочек, обычных спутников азотобактера. Никогда или лишь очень редко встречаются спороносные бациллы, что облегчает работу выделения, так как избавляет от необходимости все время прибегать к автоклаву для стерилизации.

Освободить культуру от этого небольшого загрязнения можно более или менее быстро — через один или два пересева на кремнекислые пластинки, пропитанные этиловым спиртом или бензойнокислым кальцием. Если необходимо, то для окончательного ее очищения прибегают к агаровым пластинкам с этиловым спиртом, что наиболее эффективно. Хорошие результаты дает применение пульверизатора для заражения пластинок суспензией азотобактера. Для этого приготовляют нужные разведения и направляют при помощи пульверизатора тонкую струю жидкости на пластинку с расстояния одного метра. Совершенно достаточно однократного опрыскивания.

Если дело касается таких же водных видов, какие мы исследовали, то прибавляют к образцу воды из пруда или реки несколько миллилитров раствора солей, который берется для пропитывания пластинок кремнекислого геля, щепотку мела и х/2 % абсолютного спирта. Жидкость быстро мутнеет. Если она становится желтой или желто-зеленоватой, то можно с уверенностью найти в ней или Az. vinelandii или Az. agilis, описанные в настоящей статье. В висячей капле легко узнать вид Az. agilis по его размерам и подвижности. Тот или другой из этих фиксаторов азота будет явно преобладать. Для получения чистой культуры выгоднее исходить из такой неочищенной культуры, в которой находится чистая, т. е. однородная раса, так как труднее разделить двух микробов-фиксаторов, чем очистить их от загрязнения. В условиях наших опытов загрязнение не бывает значительным: очень небольшое число спирилл, маленький кокк, две или три мельчайшие палочки — все эти организмы встречаются в небольшом количестве. Пересевы производят в раствор с этиловым спиртом несколько раз,- через каждые 24 часа. Этого обычно достаточно, чтобы почти полностью избавиться от всякого загрязнения, за исключением, может быть, кокка, наиболее обычного спутника фиксаторов азота. Тогда прибегают к твердым средам — к кремнекислому гелю или агару — с непременным прибавлением этилового спирта как единственного питательного органического вещества.

В качестве лабораторного режима для настоящего, истинного рода Azotobacter, который образует цисты, обязательные периодические пересевы культур не необходимы и даже не рекомендуются. Рациональнее и практичнее хранить такие штаммы в инцистированном виде. Для этих целей выращивают культуру на пластинке из кремнекислого геля, наблюдая за ней до полного инцистирования; после этого пластинку сушат при 40—45° и собирают сухие корочки, по возможности стерильно, в стерильную же маленькую пробирку. При таком хранении в покоящемся состоянии штамм будет предохранен от возможности каких-либо изменений под влиянием длительного культивирования в искусственных условиях. Вместе с тем при необходимости возродить культуру достаточно только бросить несколько корочек в жидкую питательную среду.

Цисты обладают большой жизненной стойкостью. Мы без ошибки получали культуру Az. vinelandii из сухих корочек, сохранявшихся около двух лет. Другие авторы сообщают о развитии культур Az. chroococcum после того, как они несколько лет хранились высохшими в пробирках на косом агаре. Омелянский нашел, что культуры этого микроба не утрачивают своей жизнеспособности на сухом косом агаре в течение десяти лет. Несомненно, что эта устойчивость к высушиванию объяснялась наличием цист, которые были в этих культурах, хотя авторы и не упоминают об этом. Однако нетрудно убедиться, что культуры, лишенные тшст, теряют жизнеспособность после высушивания. Но даже и предохраненные от высушивания они через несколько месяцев все равно теряют* свою жизнеспособность, подвергаясь автолизу. На фиг. 18 табл. XXXIII изображена не инцисти- ровавтааяся культура Az. vinelandii на агаре, сохранявшаяся около 3—4 месяцев: клетки микроба превращены в округлые раздутые образования с расплывчатыми контурами и утратили способность окрашиваться.

Что касается водных фиксаторов азота, не образующих цист, таких как те, которых мы объединили под именем азомонад, то для того чтобы сохранить их живыми в течение нескольких месяцев, нужно по окончании их активного размножения лишь хорошо закрыть резиновыми колпачками ватные пробки конических колб. В этом случае неизбежны периодические пересевы.

После краткого изложения итогов наших морфологических исследований нам остается лишь сделать из них некоторые выводы общего характера.

1. Изучение морфологии азотобактера особенно поучительно, потому что на этом примере приобретают большую наглядность те же принципы, которые лежат в основе морфологических исследований над Schizomyce- taceae вообще и которые в конечном итоге имеют большое общебиологическое значение. Каков бы ни был микроорганизм, подлежащий изучению с морфологической точки зрения, в его характеристику неизменно войдут все последовательные формы, через которые он проходит в течение цикла своего развития, а также порядок их смены; но эти наследственные черты могут выявляться с известной степенью устойчивости лишь в условиях, соответствующих приспособительным особенностям вида; если эти условия будут отклоняться от естественных, то вид будет на это реагировать с большей или меньшей чувствительностью, давая уклоняющиеся стадии развития; эти стадии составят своего рода патологическую морфологию микроба, которую не следует принимать за нормальную. Несмотря на всю очевидность приведенных положений, против них много грешили в течение семидесяти лет, прошедших от начала настойчивых бактериологических исследований, и история развития морфологических изысканий ясно нам показывает, что именно непризнание этих основных принципиальных положений всегда являлось источником плохо обоснованных доктрин, современным рецидивом которых является теория циклогении.

Далее совершенно очевидно, что чем больше будут отличаться естественные условия обитания вида от его лабораторного режима, тем скорее он отклонится от своего нормального цикла развития и превратится в искусственный вариант. Единственное средство, способное предупредить такое превращение,— это создание в лаборатории, насколько это возможно, условий, сходных с природными. Но для этого необходимо составить себе о них ясное представление при помощи предварительных опытов; один из методов, пригодных для этих целей, указан в нашей статье 1932 г.

Отклоняющиеся формы, часто служившие объектом споров с точки зрения их жизнеспособности, не всегда бывают так называемыми инволюционными формами, неизбежно предназначенными к дегенерации. Как можно было убедиться, они особенно часто появляются на средах, содержащих «хорошие питательные вещества», .что заставляет думать, что здесь дело касается гипертрофии клеток, судя, кроме всего прочего, по их массивной уродливой форме. Такому же состоянию гипертрофии можно, видимо, в равной мере приписать и почкование. Высказанное пред- положение подтверждается следующим фактом. Культуры на глюкозе и я маините очень обильны, они кажутся цветущими и сохраняют спосооност перевиваться в течение бесконечного числа лет. И все же размножающийся в этих условиях азотобактер является лишь лабораторным вариантом и очень часто уродом.

2.         Для более углубленного исследования деятельности аэробных фиксаторов азота в природных условиях было бы полезно прибегать как можно чаще к их выделению из почвы и воды, вместо того чтобы пользоваться коллекционными культурами. Подобный прием исследования привел бы к лучшему ознакомлению с их экологией. Возможно, что это позволило бы также пополнить эту группу новыми видами или расами, пока еще неизвестными.

3.         Группа организмов, которой мы предполагаем дать родовое имя 'Azc monos и которые местом своего обитания выбирают воду, представляет собой объект исследования еще очень мало изученный. Их надо искать в реках и прудах с величиной рН не ниже 7,0 и не загрязненных сточными или фабричными Еодами, бедных азотом.

4.         Интенсивность размножения микробов-фиксаторов за счет этилового спирта обращает внимание на роль последнего при фиксации молекулярного азота. Мюнц первый указал на постоянное присутствие спирта в почве. С того времени этот факт был многократно подтвержден. Егеру в лаборатории Стоклаза удалось, подвергая почву давлению в 350—400 атм., извлечь из одного килограмма от 4 до 5 мг спирта. Это количество, конечно, не может считаться значительным, но его потребление обеспечено азот- фиксатором, особенно когда среда бедна связанным азотом.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ