АЗОТОБАКТЕР

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

ОБ АЗОТФИКСИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ПОЧВ

Современная наука считает азотобактер самым активным возбудителем фиксации азота. Таким образом, от его присутствия и от его активности зависит в первую очередь азотфиксирующая способность почвы.

Вопрос, насколько эти микроорганизмы распространены в почве, вызвал многочисленные исследования с самого начала их открытия. Стандартный метод, которым для этого пользовались, состоял в заражении жидкой питательной среды Бейеринка (2%-ный раствор маннита с прибавлением фосфата калия и мела) несколькими граммами почвы. Было установлено, что около половины образцов не дает роста на такой среде. Но примененная методика была слишком малочувствительной, чтобы заслуживать полного доверия: отсутствие развития азотобактера могло зависеть не от отсутствия его зародышей в почве, а от их малочисленности, неактивности или, наконец, от малоблагоприятных условий, которые они для себя находили в жидкой среде (конкуренция с анаэробами). Таким образом, могло случиться, что образцы почв, слабо населенные азотобактером, могли быть неправильно определены как совершенно лишенные зародышей этого микроорганизма. В общем, этот метод, первоначально использованный Бейеринком для открытия азотобактера и получения его первых культур из почвы, оказался хорошим лишь для этих целей. Слишком элементарный, он был непригоден для изучения распространения азотобактера и для оценки его роли в природе. Одно констатирование присутствия зародышей этого микроорганизма еще ничего не говорит об этой роли, если ничего не известно об их плотности в среде и об их активности.

Для изучения же активности азотфиксаторов придерживались в сущности той же самой методики, лишь увеличивая количество посевной почвы до 10 г на 100 см3 питательной среды. Культуры ставились в термостат на срок от двух «недель и до месяца, а под конец в них определялась прибыль азота. Эта прибыль, которая изменялась в зависимости от образца, принималась за мерило азотфиксирующей способности данной почвы. Были ли основания так считать? Мы этого не думаем.

Увеличение количества почвы, взятой для посева, конечно способствует проявлению в культурах характерных особенностей различных почв, сравниваемых между собою, но чтобы опыты подобного рода могли служить для сравнительного изучения, необходимо ввести в него элемент времени (см. статью V), т. е. надо определить энергию или быстроту протекания процесса азотфиксации, вызванного исследуемой почвой. В этом случае можно будет убедиться, что почва, богатая азотобактером, быстрее разложит маннит, давая при этом максимальную прибыль азота или же даст определенную прибыль в более короткий срок. Над этим вопросом не задумывались, и срок инкубации всегда давался достаточно длинный, для того чтобы культуры почв, богатых или бедных азотобактером, могли вызвать один и тот же эффект. Если же тем не менее наблюдалась разница в конечной прибыли азота, то это можно было бы объяснить скорее условиями развития культур в жидкой среде, чем особенностями самих почвенных образцов. Весьма вероятно, что все эти колебания в прибыли азота вызывались вмешательством только анаэробного фактора, влияния которого в жидкой среде избежать невозможно. Если начинало преобладать развитие анаэробов, прибыль азота снижалась, если же верх брал азотобактер, то она увеличивалась. Такая конкуренция приводила к целой гамме переходов в зависимости от соотношения этих двух явлений.

Таким образом, методика была основана лишь на недоразумении. Она неспособна была дать даже в самых общих чертах представление об активности азотобактера в почве, иными словами, об его азотфиксирующей способности.

Вторая методика, предложенная Кристенсеном, использует для своих целей разложение маннита, прибавленного к почве. За разложением маннита следят, титруя перманганатом; эти определения повторяются в течение месяца через каждые пять дней.

Развивается ли этот процесс параллельно процессу фиксации азота и наблюдается ли постоянное соотношение между количествами разрушенного маннита и фиксированного в этих условиях азота? Об этом ничего определенного не знают. Уже ранее известные факты, равно как и новые наблюдения, которых мы коснемся в настоящей статье, заставляют скорее думать, что величина этого соотношения зависит от азотного режима почв, как известно, очень изменчивого. Но начать учитывать последнее — значило бы настолько усложнить метод, что им было бы трудно пользоваться.

Таким образом, методика Кристенсена основана на очень спорном допущении. В ней нет ничего микробиологического, так как она не предусматривает изучения самих возбудителей процесса. Наконец, она требует длительных манипуляций и поэтому мало практична, чтобй служить для повседневных испытаний.

Подводя итог, надо признать, что прежние исследования по двум поставленным вопросам — распространению и активности азотобактера в почвах — дали лишь несовершенную методику для первого из них. Что же касается методики для определения активности специфического населения почвы, иными словами, методики определения азотфиксирующей способности почв, то она еще полностью отсутствует.

Важное значение быстрой и надежной методики для сравнения азотфиксирующей способности различных почв совершенно очевидно. Лишь многочисленные и последовательные опыты позволят выяснить, какие условия благоприятствуют и какие тормозят развитие этого лроцесса ^различных почвах.

Как это уже было уточнено одним из нас в другом месте, методика должна дать возможность определять не только присутствие специфических зародышей азотфиксаторов в их естественной обстановке, Но также их плотность и их активность в той же самой почве. Техника, выработанная для этих целей, была подробно описана в наших предыдущих заметках и статьях.

Напомним, что этот метод включает: 1) большие пластинки (диаметром 20 см) кремнекислого геля, пропитанные элективной средой и засеянные 1 г абсолютно сухой почвы данного образца; 2) самопроизвольные или естественные культуры в самой почве, насыпанной рыхлым слоем или вмазанной в виде почвенных пластинок.

Плотность азотобактера, определенная при помощи этого прямого метода, является одним из важных факторов для суждения о фиксирующей деятельности почвы. Однако было бы ошибочно считать, что зародыши азотобактера, встречающиеся в естественной среде, находятся здесь постоянно в активном состоянии; нет никакого сомнения, что очень часто они присутствуют в почве в качестве покоящихся, латентных форм вследствие неблагоприятных условий для их размножения. Таким образом плотность зародышей в почве не всегда соответствует их активности. Действительно, прежние наблюдения нам уже показали,что встречается много почвенных образцов, пригодных для получения колоний азотобактера на больших пластинка х из кремнекислого геля, но неспособных давать самопроизвольные культуры. Последнее говорит о том, что зародыши азотфиксаторов не могут размножаться в почве, в которой они обитают, но хорошо развиваются вне ее на приспособленной для этого среде. Почва стала для них бесплодной и это бесплодие, вероятно, принуждает их перейти в покоящееся состояние. Отсюда с полной очевидностью вытекает важность применения метода самопроизвольных культур, который следует расценивать как специальное испытание активности клеток азотобактера в почве.

По вопросу о том, что является причиной бесплодия почв, которое так поражает в опытах с самопроизвольными культурами, совершенно естественно обратиться к прежним наблюдениям (Гейни, Кристенсен, Сто- клаза, Никлас, Ваксман и др.)» которые показали важность реакции почвы (наличие извести) и присутствия усвояемой фосфорной кислоты для этих организмов. Более того, напрашивается мысль, что в данном случае дело может касаться лишь минеральных веществ в качестве непосредственной причины отсутствия размножения азотобактера, так как энергетическое вещество находится в почве в избытке и имеются все необходимые условия для развития азот- фиксаторов. Это вызвало желание попробовать комбинировать метод самопроизвольных культур с отыскиванием минерального лимитирующего фактора. Для этой цели достаточно прибавить к почве извести или растворимого фосфата; если это те соли, которых недостает для плодородия почвы, то удобренные ими порции почвы дадут значительный рост азотобактера, тогда как в порциях почв, не обработанных этими веществами или обработанных неправильно, развития микроорганизма не произойдет.

Опыты с почвой, насыпанной рыхлым слоем, дают результаты, параллельные с почвенными пластинками (см. статью V); практичнее применять эти последние, так как на них колонии видны простым глазом.

Что касается техники приготовления этих пластинок, описанной выше, то при последующих исследованиях выучились ее видоизменять, учитывая специфические особенности различных почв. Для тяжелых, глинистых доч,в в качестве энергетического вещества употребляют крахмал, тогда как в случае легких почв его заменяют маннитом, в количестве 1 %, прибавляя сверх того до 20% очищенного каолина в порошке, чтобы увеличить вязкость почвы.

Такое видоизменение метода оказалось необходимым, так как почвы легкого механического состава, богатые азотобактером, при прибавлении в них крахмала не давали хорошо различимых колоний микроорганизмов, но как только последний заменяли маннитом, появлялось огромное количество их после установленного срока в 48 часов. Причину этой разницы надо, видимо, искать в том, что глинистые почвы содержат гораздо больше анаэробов, которые способны быстро воздействовать на крахмал, превращая его в декстрин — излюбленное питательное вещество азотобактера (Омелянский), в то время как в легких песчаных почвах, бедных анаэробами, это превращение происходит, видимо, такими темпами, при которых невозможно обильное развитие азотфиксаторов. Таким образом, применяют то или другое энергетическое вещество в зависимости от физических свойств исследуемого почвенного образца.

Чтобы приготовить пластинки, нужное количество почвы просеивают через 2-миллиметровое сито, тщательно смешивают с 5% крахмала или 1% маннита; разделяют почву на три (или четыре) части, из которых одну, об значенную 0 (нулем), замешивают в тесто, приливая в нее дистиллированную воду, со второй, помеченной Са, поступают точно так же, но предварительно внеся в нее 2—3% извести; наконец, третья, Р, превращается в тесто при смешении почвы с 0,1 % раствором смеси одно- и двуосновного фосфата натрия, дающей рН, равное 7,0—7,1. Можно было бы еще расширить эти опыты, внеся в четвертую порцию почвы соли калия и применив ряд других комбинаций из тех же самых минеральных веществ.

Если в указанном опыте на всех трех пластинках через 48 часов стояния при 30° появляются многочисленные колонии азотобактера без заметной разницы в их числе или интенсивности развития, то можно сделать вывод, что почва содержит достаточно извести и фосфорной кислоты (см. фиг. 1 табл. XXVIII). Если же, наоборот, они развиваются лишь на пластинке, помеченной Са (см. фиг. 2 табл. XXVIII), или на пластинке Р (фиг. 3 табл. XXIX), то это указывает, что недостаток этих веществ делает почву бесплодной и переводит азотфиксатор в неактивное состояние.

Как видно, эта очень простая методика опытов может дать достаточно точные указания на особенности почвы, которые характеризуют ее способность к азотфиксации.

Понятие о лимитирующем минеральном факторе было внушено опытами с самопроизвольными культурами 'азотобактера. В дальнейшем мы коснемся всех других факторов, которые благоприятствуют явлению фиксации или, наоборот, препятствуют ей.

Развитие микроба, само собою разумеется, происходит за счет углеводов, которые являются источником углерода и энергии.

К сожалению, мы сталкиваемся здесь с одним из самых серьезных пробелов в наших знаниях по вопросу об азотфиксации в природных условиях, каковы же вещества, за счет которых может происходить фиксация в поч- Ве полей?

Правда, растительные остатки, погребенные в почве, могут явиться Уточнит лами различных Сахаров и крахмала; известно также, что азотобактер способен утилизировать достаточно большое число спиртов и Различных органических кислот.

Возможно было несколько ответов на поставленный вопрос, и они были выдвинуты: 1) использование при азотфиксации веществ, называемых гуминовыми; 2) симбиоз с целлюлозуразрушающими ^бактериями- 3) симбиоз с водорослями; 4) корневые выделения высших растений, которые доставляют энергетическое вещество фиксаторам, обитающим в их «ризосфере».

Интересные опыты были проведены различными учеными для подкрепления этих взглядов, но ни один из них не был достаточно убедительным не только для того, чтобы повлечь за собой какие-либо выводы, но даже и для того, чтобы послужить солидной базой для обсуждения. Таким образом, вопрос остается до сих пор широко открытым и мы, к сожалению, должны признать, что наши собственные, еще не опубликованные, исследования не продвинули его вперед более, чем предыдущие.

В опытах с фиксацией азота в почве приходится обходить это затруднение, прибавляя в качестве энергетического вещества маннит, несмотря на то, что он не может служить для этих целей в естественной среде. Но экспериментатор должен «обогащать» этим искусственным веществом почву, так как иначе она не дала бы ни самопроизвольных культур, ни достаточно высокой фиксации, для того чтобы ее можно было установить при помощи химического анализа в течение не слишком длительного срока. Таким образом, наши самопроизвольные культуры отличаются от почвы качеством и количеством энергетического вещества и это является уступкой sine qua поп необходимых условий экспериментальной работы.

Второе очень важное условие, от которого зависит активность азотобактера в. почве, касается содержания доступного в ней азота. Этот доступный азот, как известно, встречается главным образом в виде нитратов и аммонийных солей. Неоднократно удавалось констатировать, что эти вещества очень хорошо усваиваются в чистых культурах азотобактера, покрывая полностью потребность в азоте этого микроорганизма, который в данных условиях прекращает его фиксировать. Что же касается самопроизвольных культур, то уже первые исследования установили, что среда является элективной для азотобактера лишь при условии отсутствия связанного азота.

Таким образом, было основание считать, что то же самое необходимо для того, чтобы обеспечить преобладающее развитие азотфиксаторов в почве. Опыты с самопроизвольными культурами полностью подтвердили этот взгляд. Они позволили установить, что внесение минимальных доз связанного азота изменяет характер развития почвенной микрофлоры, .исключая из нее азотфиксаторов.

Оставалось доказать, что фиксация действительно в этом случае подавляется, и определить количество связанного азота, необходимое для ее полного устранения. С того момента, как дело коснулось биологического фактора, было наиболее целесообразно применить методику пластинок из кремнекислого геля, которые воспроизводят своего рода идеальную почву и дают возможность легко следить за прорастанием и развитием различных популяций микроорганизмов и их качественными и количественными соотношениями. Кроме того, эти пластинки более пригодны для опытов с точными дозировками, чем почва.

Такая серия опытов была проведена при помощи методов, описанных ранее (см. опыты по фиксации, статья V). Маннита вносилось 2 г на пластинку. Все пластинки были засеяны одним и тем же образцом почвы «шпа- лйпных посалок» и выдеоживались при 30° семь дней,— срок более чем

достаточный для полного разложения маннита (нормальный срок для этой почвы пять дней). На каждую дозу нитратного азота брали по две пластинки.

Все чашки просматривались ежедневно и отмечалось их состояние через 48 часов после заражения, когда появлялись колонии, и через 4—6 дней — сроки, в которые начиналось и заканчивалось побурение колоний азотобактера.

Приведем макроскопические и микроскопические наблюдения над пластинками.

1.         П л а с т и нк и с 1мг нитратного азота. Через 48 часов — около 3000 колоний азотобактера, небольшая примесь спороносных палочек.

Через 4 дня — пластинки полностью побурели; в общем почти никакой разницы с контрольными пластинками без азота.

2.         П Лца стинки с 3 мг нитратного азота. Через 28 часов — число колоний азотобактера мало сократилось. Много крупных палочек.

Через 4 дня — частичное побурение.

Через 6 дней — большие бурые пятна, разделенные белыми островками.

3.         Пластинки с 5 мг нитратного азота. Через 48 часов — смесь азотобактера с палочками 1:1.

Через 4 дня — побурение в виде небольших пятен.

Через 6 дней — несколько бурых пятен, много колоний палочек, немного плесеней.

4.         Пластинки с 10 мг нитратного азота. Через 24 часа — пластинки почти целиком покрыты мелкими колониями палочек.

Через 48 часов — колонии азотобактера появились в ограниченном числе (трудно сосчитать между бациллярными колониями, которые их окружают).

Через 4 дня — энергичное развитие нескольких хороших колоний азотобактера.

Через 6 дней — пластинки с бурыми пятнами азотобактера; сплошной бациллярный налет. Плесени.

5.         Пластинки с 15 мг нитратного азота. То же самое, но выражено более резко, больше палочек и плесеней, меньше азотобактера.

6.         Пластинки с 20 мг нитратного азота. Через 24 часа — пластинки целиком покрыты колониями палочек.

Через 48 часов — азотобактера нет.

Через 4 дня — несколько колоний азотобактера, окруженных сплошным налетом из палочек; обильный мицелий.

Через 6 дней — пигментация слабо окрашенными пятнами; палочки; сильное развитие плесеней.

При внесении 25—30 мг нитратного азота трудно или невозможно обнаружить азотобактер среди массы палочек, которые уже через 24 часа полностью покрывают пластинки. Брожение начинается сразу. Запах спирта, обилие плесеней

Эти наблюдения, присоединенные к тем, которые мы приводили, не оставляют никакого сомнения относительно роли связанного азота, который, как совершенно ясно, способствует развитию антагонистического биологического фактора в почве, подавляющего или даже прекращающего деятельность азотфиксаторов. Такое подавление вызывается не столько самим соседством с палочками и продуктами их обмена,— так как наблюдаются прекрасные колонии азотобактера рядом и даже окруженные или смешанные с колониями палочек,— сколько быстрым окислением энергетического вещества, вызываемым бациллами. Опережая всегда азотобактера, они оставляют ему все меньше и меньше углеводов, по мере того как увеличивается количество доступного связанного азота в среде. Они просто вытесняют азотобактера, не причиняя ему, повидимому, вреда; микроорганизм не может больше обильно размножаться, вследствие чего питательное вещество расходуется не на фиксацию азота, а на ДРУ~ гие нужды. Таким образом, от содержания связанного азота в среде зависит до некоторой степени потребление энергетического вещества, идущего на процесс фиксации, что связано с количеством и активностью азотобактера в почве.

Однако биологический антагонистический фактор может действовать, как это можно себе представить, лишь медленно и непрерывно. Азотобактер, в меньшем количестве, но все же сохраняется в почве, выжидая благоприятного момента — момента истощения азотного запаса — для нового наступления при условии, что запас энергетического вещества возобновится в почве или что отношение N : С упадет слишком низко для того, чтобы было возможно развитие палочек. Но каковы бы в этом случае ни были колебания в том или другом направлении, баланс в почве, бедной азотом, за тот же промежуток времени и при эквивалентном количестве энергетического вещества, приведет к более энергичному развитию азотобактера, чем в почве, им богатой.

В согласии с этим взглядом стоит факт, что такие вещества, как ком- посты, высушенные и размельченные в порошок фекалии, очень старый навоз, полностью разложившиеся и превратившиеся в необычайно плодородную почву, содержат в грамме лишь единичные клетки азотобактера (очевидно случайно туда попавшие) или совершенно их лишены, как это доказывает приводимый ниже опыт.

Навоз, которым в этом случае мы пользовались, сохранялся в течение трех лет в маленьких кучах, менее метра высотой, на почве, богатой азотобактером; фекалии были взяты из кучи, остававшейся более года на земле; компост был хорошо приготовлен (два года) и имел интенсивно черную окраску.

Ни в одном из этих веществ не развивались самопроизвольные культуры азотобактера.

Полученные цифры, как видно, очень незначительны, почти ничтожны; они не оставляют сомнения в том, что никакого сравнительно недавнего размножения клеток азотобактера здесь не происходило и что не может быть вопроса о фиксации азота в этих условиях.

В таких, до известной степени крайних случаях простого химического анализа достаточно, чтобы охарактеризовать азотный режим почв, так как большой запас общего азота позволяет предполагать, что часть его Постоянно переходит в усвояемую форму, так что антагонистический фактор имеет все возможности проявить свое действие. Иначе обстоит дело в природных условиях на полях, в почвах, в которых количество общего азота обычно колеблется около 0,1% и в которых химический анализ обнаруживает лишь чрезвычайно небольшие и, кроме того, очень меняющиеся количества ассимилируемого нитратного или аммиачного азота. Задача Характеризовать их азотный режим последовательными химическими анализами была бы очень сложна. Несравненно проще и даже надежнее в таком случае обращаться к данным, касающимся обработки изучаемых почв, главным образом их режима в смысле вносимых в них удобрений. Сравнение почв, различным образом обработанных, даст возможность изучить воздействие интересующего нас биологического фактора на фиксирующую способность естественных почв.

Опыт такого рода будет приведен в дальнейшем.

Нами указывалось, что методика, которую мы рекомендуем, касается лишь азотобактера, не считаясь с другими микроорганизмами, принимаемыми в микробиологии за фиксаторов азота.

Но надо сказать, что в почве, находящейся в нормальном состоянии, т. е. в почве аэрируемой и не насыщенной влагой, преобладают аэробные фиксаторы азота. Анаэробная фиксация, возбудителем которой является Clostridium, развивается лишь иногда в специальных условиях, и прибыль азота в анаэробных условиях всегда ниже, чем в аэробных, достигая лишь около половины величины последней (см. статью V).

Что касается числа бактериальных видов, выделенных различными авторами из разнообразных сред — почвы, навоза, молока, или выбранных из культур известных нам видов (между ними и патогенных), то признанная за ними некоторая способность к азотфиксации (Стоклаза, Якобиц, Конвалевский, Нейде, Лёнис и Пиллаи, Вестерман, Липман, Перотти, Честер, де Крюи, Трюффо и Бессонов и др.) еще далеко не бесспорна.

Действительно, многочисленные опыты с образцами почв различного происхождения, которые в течение четырех лет проводились в нашей лаборатории, обнаруживали в аэробных условиях присутствие лишь одного азотобактера. Иногда под защитой слизистых масс последнего развивался Clostridium, предохраненный таким способом от прямого воздействия кислорода воздуха.

В том случае, когда азотобактер не развивался, пластинки оставались стерильными или давали начало мелким и слабым колониям палочек, рост которых быстро останавливался, не обнаруживая заметной прибыли азота (статья V, Опыты по фиксации азота).

Эти многочисленные прямые наблюдения дают нам право думать, что, с одной стороны, в почве надлежит считаться лишь с фиксаторами, принадлежащими к двум классическим группам, а с другой, что методика определения фиксирующей способности почв должна опираться на деятельность азотобактера, преобладающую в природе.

Прежде чем перейти к подробному описанию примера, который будет иллюстрировать опыт в целом, следует уточнить наилучший способ постановки таких опытов: очень простые, они нуждаются, однако, в определенной схеме, чтобы дать достаточно ясные результаты.

Прежде всего надо заметить, что вопрос касается не абсолютных величин и что даже невозможно представить себе какую-то общую меру, пригодную для определения интенсивности фиксирующей способности всех почв. Чтобы их можно было использовать, опыты должны носить региональный характер, т. е. ограничиваться сравнением азотфиксирующей способности почв одного типа. Они должны одновременно проводиться по меньшей мере с десятком таких образцов, причем необходимо выбирать поля и делянки, в которые вносились различные удобрения. С каждой делянки, соблюдая обычные предосторожности, берут среднюю пробу, которую изучают по возможности без промедления.

Такого числа проб обычно достаточно, для того чтобы напасть на образец, который давал бы большое число колоний азотобактера на пластинках. В таком случае через установленный срок в 48 часов, при температуре 30°, поверхность геля покрывается центрами роста азотобактера, настолько многочисленными и сближенными между собой, что они почти соприкасаются. Такой рост соответствует многим тысячам клеток азотобактера на 1 г почвы. Самопроизвольные культуры развиваются также через 48 часов в рыхлом слое почвы и в виде мелких колоний на поверхности почвенных пластинок.

Отсюда можно заключить, что исследованный образец почвы густо населен этими возбудителями фиксации азота и что они сохраняются в нем в активном состоянии. Такой образец принимается за стандарт и с ним сравнивают другие образцы изучаемой серии почв, плотность населения которых азотобактером выражают в процентах стандарта, фиксирующая же способность считается пропорциональной плотности азотобактера в почвах, подвергнутых исследованию.^

Такое допущение не соответствует в точности действительности* В самом деле, в образцах почв с очень незначительной плотностью азотобактера азотфиксирующая способность, весьма вероятно, уже подавлена. Но если захотят определить нижнюю • границу плотности, с которой начинается неактивность азотобактера, то сомнительно, чтобы было возможно получить в этом отношении достаточно ясный результат; кроме того, трудно не учитывать потенциальную способность почв к процессу азотфиксации, определяемую запасом зародышей азотфиксаторов в почве — носителей этой способности, несмотря на их неактивность в данный момент. Следовательно, такое допущение представляется достаточно логичным и не может привести к серьезным ошибкам.

В общем весь опыт сводится: 1) к засеву образцом почвы двух пластинок кремнекислого геля; 2) к приготовлению серии из 3 (4) почвенных пластинок данного почвенного образца; 3) к подсчету колоний азотобактера появившихся на геле через 48 часов стояния при температуре в 30°; 4) к просмотру почвенных пластинок через тот же срок; 5) к повторным просмотрам их в течение двух дней при продолжающемся пребывании их в термостате при 30°.

Эти простые и быстрые манипуляции достаточны, чтобы получить данные, необходимые для сравнительной диагностики фиксирующей способности изучаемой серии почв.

К этому опыту можно было бы еще добавить количественные определения прибыли азота, фиксированного почвами различных образцов. Но чтобы эти определения не спутали полученных результатов, надо начать с установления минимального срока, необходимого стандартной почве для получения максимальной прибыли. Этот срок должен быть точно определен специальными опытами. Тогда его принимают для всей серии производимых определений и подвергают пластинки высушиванию тотчас по истечении этого срока. Если придерживаться этих указаний, то можно убедиться в постепенном возрастании прибыли фиксированного азота параллельно с увеличением плотности зародышей азотобактера.

Этот факт имеет большое значение, как прямое доказательство того, что плотность азотобактера может в конечном итоге соответствовать его активности в почве. Но, к сожалению, плотность азотобактера в почве далеко не пропорциональна прибыли азота н а пластинках, вследствие того, что редкие и разбросанные по пластинке колонии этого азотфиксатора развиваются гораздо интенсивнее чем колонии многочисленные и сближенные между собой. Так, например^ если предположить, что в 1 г почвы содержится лишь одна клетка азотобактера, то на пластинке, засеянной граммом такой почвы, должна вырасти лишь одна колония, но эта колония, разрастаясь и покрывая несколько десятков квадратных сантиметров пластинки, сможет в течение пяти дней довести фиксацию азота до 2 мг, тогда как почва с количеством клеток азотобактера, в 5000 раз большим, будет в состоянии усвоить в тех же условиях за счет 2 г маннита самое большее лишь 20 мг азота т. е. всего лишь в десять раз больше.

Таким образом, опыты по фиксации азота даже в описанной постановке могут лишь в самой общей форме подкрепить факт существования связи между плотностью азотобактера и энергией фиксации. В качестве же мерила азотфиксирующей способности почвы определения усвоенного количества азота скорее способствуют тому, чтобы замаскировать или сгладить истинные соотношения, так что предпочтительнее от таких определений отказаться.

Это мнение не согласуется со взглядом, высказанным в нашей статье V и так часто цитируемым, согласно которому возможно характеризовать почвы по количеству азота, фиксированного ими на пластинках из кремнекислого геля. Этот признак, как мы только что говорили, полностью не исключается, но более многочисленные и систематические опыты заставили нас придавать ему меньшую ценность.

Эти же самые опыты привели к некоторому изменению наших взглядов и на активные или стандартные почвы. Особенности, которые мы им приписывали,— а именно, плотность азотфиксатора от двух до трех тысяч на 1 г, фиксация 20 мг азота на 2 г маннита в течение пяти дней,— не представляются нам сейчас таким общим правилом, как мы это думали на основании многочисленных образцов, которые до тех пор прошли через наши руки. Уже после этого в серии образцов почвы, собранных на юге Франции, были обнаружены несколько иные свойства: в них плотность азотобактера доходила до 12 000 на 1 г, максимум азотфиксации достигался уже через четыре дня (от 90 до 96 часов), но продуктивность была ниже. Об этом будет говориться в следующем разделе.

Чтобы иллюстрировать нашу методику, мы выберем серию опытов, проведенных с почвами из окрестностей Монпелье, которые дали нам самые поучительные результаты. В этом случае у нас была возможность — довольно редкая в условиях нашей работы — исследовать образцы почв, режим которых находился под научным контролем в течение известного числа лет. Эти образцы были собраны на территории опытного виноградника Граммон около Монпелье, возглавляемого профессором Лагату. Они были взяты с десяти делянок, в которые вносились различные удобрения; тотчас же пересланные по нашему адресу, они были изучены нами без замедления. Согласно нашему желанию, образцы попали к нам помеченные лишь номерами делянок без указания на режим, которому они подвергались. Сведения о последнем нам были сообщены позднее в обмен на полученные нами результаты. Мы чрезвычайно обязаны проф. Лагату за его ценное содействие.

Состав основного удобрения на гектар:

Азот: 80 кг, из которых 40 кг в виде сушеной крови, 20 кг в виде роговой муки, 20 кг в виде нитрата калия.

Калий: 90 кг, из которых 66 кг в форме нитрата, 24 кг в форме

сульфата.

Фосфорная кислота: 75 кг в виде суперфосфата.

Такое удобрение было внесено на делянку 3  , которая является делянкой- стандартом опытного поля. Делянка 4 представляет собою контроль без удобрений. Для остальных же восьми делянок изменяли схему, или опуская один из элементов N, Р, К, или увеличивая вносимые количества, или, наконец, прибавляя известь или железо, как это отмечено во второй графе таблицы, помещаемой ниже.

Такой режим поддерживался в течение шести лет.

Тип почвы: альпийский бескарбонатный дилювий. Опыты были проведены точно по уже изложенному плану.

Результаты приведены в нижеследующей таблице и показаны на 76. В обоих случаях образцы, обозначенные номерами делянок, на которых они были взяты, расположены в порядке уменьшения их азотфиксирующей способности.

В начале графика (76) так же, как и в таблице находится делянка 3, которая является стандартом для наших опытов. Плотность азотобактера 12 ООО. Самопроизвольные культуры богатые. Ограничивающий фактор отсутствует. Режим: никакого азота, лишь минеральные удобрения.

Далее следует делянка 4, населенность которой азотобактером 2600, что составляет 21% стандарта. Лимитирующим фактором, который особенно выделяется, является фосфорная кислота (Р). Режим: никакого удобрения.

Делянки 21, 6, 9, 8, 2 мало различаются между собой. Плотность азотобактера, когда она внезапно и очень низко падает, колеблется лишь с пределах от 360 до 600, составляя от 3 до 5% стандарта. Режим: 80 кг азота, согласно схеме, и минеральные удобрения. Делянка 8 получает даже двойную дозу азота. Делянка 21 лишена фосфорного удобрения: самопроизвольные культуры также его требуют (Р — лимитирующий фактор). Делянка 9 была известкована с добавлением основного удобрения, но это не оказало никакого влияния на азотобактер; это доказывает, что не недостаток извести угнетает этого азотфиксатора. Однако известь не была в избытке в этой неизвестковой почве, так как было достаточно на делянке 2 лишить почву солей калия, чтобы в ней начал ощущаться недостаток в основаниях. Отсюда Са — лимитирующий фактор!

Наконец, делянки 12, 16 и 18 образуют последнюю группу почв, в которой уменьшение плотности азотобактера подчеркивается все более и более. В первых двух делянках она равна лишь 170 и 60 на 1 г почвы,  «г. е. составляет 1,4 и 0,5% стандарта, и она равна нулю на делянке 18 . режим: 80 кг азота для всех трех делянок и минеральные удобрения. Только на делянку 16 этот азот был внесен в виде сульфата аммония; делянка 12 получила сверх того сульфат железа, наконец, делянка 18 весь калий получила в форме хлористого, вместо смеси, в которой нитрат калия составлял три четверти. Сульфат аммония, сульфат железа и хлористый калий — все три являются физиологически кислыми солями, вследствие чего в этих почвах, слабо забуференных, ощущается недостаток в основаниях, что находит отражение в реакции почв на Са на делянках 12 и 16 (на делянке 18 это невозможно из-за отсутствия зародышей азотобактера). И можно определенно считать, что увеличение концентрации водородных ионов вызвало более быструю гибель клеток азотобактера на последних трех делянках.

В последней графе таблицы даны результаты опытов по фиксации азота на пластинках из кремнекислого геля. Эти опыты не входят в программу наших исследований. Если мы их здесь помещаем, то лишь в качестве обоснования тех соображений относительно ценности нашей методики, которые изложены выше. Эти опыты подтверждают общий факт существования связи между плотностью азотобактера в тубчве и фиксацией азота на пластинках, но отношения оказываются чре&в£гчайно затушеванными. Небольшая прибыль азота на пластинках, засеянных почвой делянки 18, не может считаться достоверной, вследствие сомнительности происхождения нескольких колоний, которые развивались на пластинках {см. сноску).

Самый интересный результат последних опытов — проявление влияния азотного удобрения, которое обнаруживается с поразительной отчетливостью. Только две делянки, которые в течение шести лет не получали такого удобрения, оказались активными; одна, 3, в состоянии полной активности, другая, 4, в состоянии ослабленной активности. В последнем случае вполне определенно лимитирующим фактором служит недостаток минеральных удобрений (Р).

Но как только дело касалось почв, в которые вносились азотные удобрения, замечалось, что плотность азотобактера сразу резко падала до цифры, указывавшей на полную его неактивность. Таким образом, связанный азот в первую очередь снижал плотность азотфиксаторов в почве, и мы, на основании наших лабораторных опытов, можем утверждать, что это действие объясняется тем, что азот стимулировал развитие биологического антагонистического фактора, подавлявшего фиксацию азота, лишая азотфиксаторов энергетического вещества. Число их в почве, в которую вносят азотные удобрения, остается незначительным и оно постепенно уменьшается все более и более по мере того, как длится этот режим; медленное в случае небольшого избытка азота, это уменьшение числа клеток азотобактера все более и более ускоряется по мере увеличения избытка азота и кончается полным исчезновением зародышей из почвы.

Лишь, в пределах, ограниченных этим постоянно действующим биологическим фактором, можно изучать влияние лимитирующего минерального вещества, которое действует немедленно. Это влияние сказывается только в группе почв, лишенных азотного удобрения; она состоит из делянок 3 и 4, относительно богатых азотобактером, причем лимитирующий: фактор Р снижает плотность этого микроорганизма на делянке 4 до 21 %. стандарта. В остальных восьми делянках, бедных зародышами азотобактера, это влияние не так заметно, но все же им нельзя пренебрегать, особенно в отношении реакции почвы. Так, почвы, в которых азотобактер реагирует на известь, определенно беднее (от 2 до 5 раз) зародышами, чем те, в которых такая реакция не замечалась.

Эта серия наблюдений, проведенная при помощи методики настолько прямой, насколько это возможно над почвами в их естественном состоянии, доказывает полную аналогию между особенностями явлейия, воспроизводимого в лаборатории и протекающего в почвах полей и виноградников. В обоих случаях мы видим, что для активности азотобактера, т. е. для проявления азотфиксирующей способности почвы, в которой он обитает, необходимы одинаковые условия. В обоих случаях один и тот же механизм становится главным автоматическим регулятором процесса: связанный азот, определяющий количество утилизируемого для фиксации азота энергетического вещества,— фактор, воздействие которого обратно его концентрации в среде.

Такое влияние вносимых азотных удобрений с агрономической точки зрения неизбежно приводит к частичной или полной потере продукта фиксации азота, предоставляемого нам природой. Этот факт бесспорно имеет большое значение для сельского хозяйства, но мы не будем останавливаться в этой статье на соображениях практического порядка, так как число проведенных нами в этом направлении наблюдений еще весьма ограничено.

Изложенная методика прежде всего предназначена для изучения фиксации азота в природе, которое едва только начинается. Ясно, однако, что реакция азотфиксаторов, таких чувствительных по отношению к лимитирующим минеральным факторам, может служить для определения этих последних в почве и притом с большей точностью, чем химические методы. Азотобактер уже играл такую роль индикатора в опытах Кри- стенсена (потребность в извести), Гейни (кислотность), Стоклаза и нескольких других ученых (потребность в фосфорной кислоте). Но старая методика, которой придерживались эти авторы, не могла дать таких точных результатов, как метод самопроизвольных культур.

Эта роль индикатора может быть теперь распространена и на изучение азотного режима почв. Это тем более интересно, что трудно составить себе ясное представление о последнем, пользуясь только химическими методами. Таким образом, повышенная плотность азотобактера в почве может считаться верным показателем бедности почвы азотом, особенно нитратами; наоборот, небольшое количество азотобактера указывает на значительное содержание в почве нитратов, но при условии отсутствия других лимитирующих факторов. Изучая количественные соотношения при помощи методов, предложенных в этой статье, можно установить для различных почв и районов те дозы азотных удобрений, которые не будут сильно угнетать азотфиксацию, предотвращая таким образом потерю ее продукции.

Будучи несомненным продвижением вперед во многих отношениях, паша методика, однако, имеет один недостаток, па который мы хотим указать в заключение: она не учитывает влияния ни качества, ни количества энергетического вещества, необходимого для фиксации азота в почве.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ