АЗОТОБАКТЕР

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

Синтез аммиака

В плане исследований по азотобактеру оставалась еще одна загадка — загадка химизма процесса, который приводит к фиксации молекулярного азота.

Начиная с 1930 г. я занялся этой проблемой, которая была предметом разнообразных гипотез, оставаясь, несмотря на это, совершенно неясной. Можно было бы сказать, что эта проблема сама возникла передо мной сейчас же, как только микробы, фиксирующие азот, начали культивироваться мною в условиях, более соответствующих их экологии. Культуры на пластинках из кремнекислого геля, пропитанных маслянокислым натрием в качестве единственного источника углерода и лишенных связанного азота, резко пахли аммиаком! Таким образом, легко было убедиться, что выделение аммиака регулярно происходило в условиях, которые исключали возможность дезаминирования. Правда, Костычев с сотрудниками уже отмечали присутствие аммиака и аминокислот в культурах двухнедельного штамма азотобактера на средах с глюкозой.

Но ими не было оговорено, имело ли место такое выделение в молодых культурах, в которых не наблюдалось никакого автолиза и которые, разумеется, были совершенно свободны от загрязнения. Точно так же они не проводили никакого микроскопического наблюдения над культурами, засеянными штаммом азотобактера, предоставленным им одним из их коллег под именем Azotobacter agilis. Совершенно очевидно, что последнее определение было ошибочным, так как несомненный вид agilis, описанный Бейерин- ком, дает лишь очень слабый рост на глюкозе и вовсе не развивается на манните. Таким образом, совершенно очевидно, что данные, полученные Костычевым, не могли иметь никакой цены в качестве доказательства, что азотобактер выделяет аммиак, который в этом случае мог быть лишь продуктом разложения или автолиза. Более того, факты, сообщаемые Костычевым, противоречили большому числу исследований, включая и мои, по которым аммиак не обнаруживался при культивировании микроба на сахаре иначе, как совершенно случайно и в виде следов.

Таким образом, на моих пластинках впервые было установлено выделение азотобактером аммиака на среде, лишенной связанного азота, с полной уверенностью, что оно производилось 48-часовой культурой микроба, проверенной в смысле чистоты, и при температуре в 30°. Это были условия, исключающие возможность дезаминирования, какой бы причиной последнее ни вызывалось. После этого надо было прежде всего доказать закономерное выделение культурами азотобактера летучей щелочи, изучить ход этого процесса и условия, которые ему благоприятствуют или задерживают его. Для этих целей были необходимы количественные опыты.

Факт наблюдаемого выделения аммиака не согласовывался с данными Бэрка, который настаивал на отсутствии в культурах азотобактера как аммиака, так и вообще каких-либо других азотсодержащих растворимых веществ. Он никогда не находил их в своих прежних многочисленных и разнообразных опытах .

На основании моих первых количественных экспериментов, которые, конечно, еще не могли окончательно разъяснить вопрос, я все же решился высказать гипотезу о синтезе аммиака за счет атмосферного азота. Это было сделано мною с целью обратить внимание на изучение роли аммиака как промежуточного продукта фиксации — старая проблема столетней давности (Соссюр;, которая, однако, осталась неразрешенной.

Действительно, хотя метода, пригодного для доказательства воздушного

происхождения выделяемого аммиака, еще не было, но для физиолога было сомнительным, можно ли приписать в этом случае выделение аммиака процессу разложения или автолизу. Ход процесса, его медлительность и особенно то, что он длится в течение многих месяцев, противоречили такому заключению. Более того, казалось невероятным, чтобы клетки микроба могли претерпеть какие-либо физиологические превращения, которые заставили бы их подвергнуться преждевременному дезами- нированию в условиях среды, лишенной азотного питания. Наконец, если бы мы имели здесь дело с клетками азотобактера, специально предрасположенными к преждевременному автолитическому дезаминированию, как это предполагает Бэрк, то были бы непонятны большие отклонения, наблюдаемые в поведении одного и того же штамма микроба в различных условиях культивирования. Так, в присутствии органических солей и этилового спирта выделение аммиака происходит энергично, в то время как в присутствии глюкозы оно слабее и запаздывает, в присутствии же маннита почти или совершенно прекращается. Между тем наиболее обильный рост азотобактера наблюдается на средах с сахарами.

Чтобы объяснить происходящее выделение аммиака, я прибег к гипотезе неустойчивого равновесия между энзиматическим синтезом аммиака и потреблением его микробом, на которое могут иметь влияние условия роста последнего.Если потребление аммиака азотобактером ограничивается большой величиной рН, как в культурах, выращиваемых на органических солях натрия, или влиянием других факторов, способных затормозить размножение его клеток, то неиспользованный аммиак выделяется в воздух. Щелочность среды мне казалась одним из наиболее эффективных факторов, могущих ограничить потребление аммиака микробом.

Эта гипотеза кажется тем более вероятной, что по исследованиям самого Бэрка над зависимостью процесса дыхания у азотобактера от величины рН, дыхание и размножение микроба останавливаются, когда эта величина приближается к 9,0. Дословно: «рост, а также и дыхание, прекращаются, когда величина рН приближается к 9,0, необратимое нарушение процесса наступает при величине рН от 8,0 до 9,0 и от 5,0 до 6,0». Это заключение Бэрка следует отметить^1шея в виду только что выдвинутую нами гипотезу .

По этому случаю заметим, что изменения под влиянием рН между 8,0 и 9,0 носят необратимый характер, вероятно, только в случае краткосрочных опытов, учитываемых при помощи микроманометрического метода. На пластинках же из кремнекислого геля клетки, очевидно, приспосабливаются в конце концов к высокой щелочности среды, с^дя по тому, что культуры, выращенные на органических солях натрия, обильны и совершенно нормальны.

В 1936 г. появилась работа Бэрка и Хорнера «О происхождении и значении аммиака, образуемого азотобактером»  . Цитируя исследования Костычева и Виноградского, авторы излагают также свои собственные изыскания, проведенные в очень большом масштабе. Авторы использовали два метода — общепринятый микробиологический метод и микроманометрический. Много сотен опытов было проведено при помбщи как одного, так и другого метода. Жестокая критика экспериментов и идей Костычева и Виноградского — эти два имени всегда связываются авторами вместе — занимает много места в этой работе.

На этот раз Бэрк вынужден признать образование аммиака, которое он с таким жаром отрицал в своей предыдущей работе. Он обнаруживает его даже в гораздо больших количествах, чем это следует из наших первых опытов; он считает, что количество выделяемого аммиака может доходить до 50% общего количества азота и выше. Но этот аммиак образуется «по всей вероятности, исключительно при разложении азота клеток и ни в каком случае не появляется, особенно в измеримых количествах,, при прямом синтезе за счет атмосферного азота».

Критика, основанная на таком большом числе столь важных доказательств, произвела свое действие. Такие ученые, как Клюйвер1, Ваксман (личные беседы) и многие другие, согласились без оговорок с мнением американских ученых. Это показалось мне вполне естественным и почти неизбежным, так как нужен очень длительный опыт обращения с азотобактером, чтобы заметить слабую сторону работы Бэрка и его сотрудников.

Меня поразило в опытах американцев, что я не находил в них больше ни типичных физиологических особенностей азотобактера, ни того характера выделения аммиака, которое мной наблюдалось. Быстрое и обильное в опытах Бэрка (2% общего количества азота за час), это выделение по своим темпам резко отличалось от того, что отмечалось в моих длительных опытах. В опытах Бэрка выделение происходило в одинаковой мере и в- анаэробных условиях, когда количество выделяемого аммиака поднималось до 10% по отношению к количеству общего азота за час. Выделение было прямо пропорционально массе клеток, откуда следовал вывод, что «клетки являются источником аммиака, а не катализаторами его продукции». Самое большое значение для продукции аммиака имеет запас углеродного питания. При исчерпании его образование аммиака ограничивается уже при падении концентрации углеродистого вещества до 0,03%. Дословно: «Самым важным фактором для оптимальных условий образования аммиака является удаление окисляющихся веществ из среды или медленно, путем дыхания, или быстро, путем механического отделения (опыт с центрифугированными и отмытыми клетками). Большинство окисляющихся веществ прекращает полностью образование аммиака при концентрации в 0,03%».

Прибавим еще, что в опытах Бэрка пастеризация в течение 15 минут при 55° или 5 минут при 75° или даже 95° останавливала выделение аммиака только на 10—15 часов, после чего процесс возобновлялся с прежней интенсивностью. Штаммы азотобактера, которые были выбраны Бэрком Для его опытов, оказались способными энергично аммонифицировать большое число производных азота — белки, аминокислоты, амиды лро- cibie и замещенные в количествах, близких к тем, в каких они выделяли аммиак за счет азота клеток. Они оказались способными даже к анаэробной аммонификации, ограниченной, однако, меньшим числом пригодных для этого веществ!

Для меня было невозможно принять ни эту критику Бэрка, пи его Результаты, которые плохо увязывались с установившимися представлениями о функциях азотобактера и резко противоречили моим наблюдениям. Именно:

1.         Слабая концентрация питательных веществ не является фактором полностью прекращающим выделение аммиака. Оно может происходить при концентрациях питательных веществ от 1 до нескольких процентов. Указанное отношение микроба, видимо, специально обусловлено применением авторами сред с сахаром.

2.         Выделение аммиака в моих опытах происходит несравненно медленнее, чем в опытах Бэрка. Для того чтобы оно прекратилось, нужны были не часы, а недели и месяцы. Процесс носил, в сущности, хронический характер.

3.         Процесс выделения аммиака не обнаруживает никакой прямой связи •с массой клеток азотобактера. Соотношение скорее обратное, если учесть обильный рост азотобактера на глюкозе и манните, при которых, однако, •образование аммиака слабее или вовсе отсутствует.

4.         Бактерии группы азотобактера —плохие аммонификаторы; количественные определения для учета этой деятельности микроба даже невозможны. Azotobacter vinelandii, по моим наблюдениям (см. статью XVI), не вызывает тмути ни в бульоне Мартина, ни в питательном растворе с аспарагином, он дает лишь слабый рост в питательной среде с пептоном. Бэрк экспериментировал с тем же видом, что и мы.

Несмотря на это, приведенные им факты противоречат нашим. Возникает вопрос — почему? Распутать это противоречие не так уж трудно, как это кажется на первый взгляд.

Для этого достаточно лишь предположить, что Бэрк и Хорнер работали с нечистыми культурами, загрязненными частью аэробными, частью анаэробными микробами, в то время как они были твердо уверены в безупречной чистоте тех коллекционных штаммов, которыми они пользовались в течение всех своих опытов. В этом заключении нет ничего позорного для авторов, когда дело касается азотобактера. Я уже много раз обращал внимание на то, что культуры азотобактера, каков бы ни был их источник и какая бы этикетка на них ни стояла, слишком часто содержат зародышей разнообразных сопутствующих им микробов, которые ничем не обнаруживают своего присутствия вначале, но которые начинают размножаться сейчас же, как только, благодаря деятельности азотобактера, среда обогащается связанным азотом. Безграничная вера в чистоту культур азотобактера была много раз источником различных ошибок. Поэтому для себя я принимаю за правило никогда не считать это достоверным, но всегда прибегать к строгому м идр оскопическому контролю в течение всего в JK^JI ени проведения экспериментов с этим микробом. Американские ученые совершенно не упоминают о микроскопическом контроле. Это умалчивание отягощается тем обстоятельством, что в большей части своих опытов они пользовались суспензией центрифугированных и отмытых клеток, долгое время сохранявшихся в дистиллированной воде при температуре 5°.

По всем этим соображениям становится весьма вероятным, что Бэрк и сотрудники изучали лишь обычный процесс разложения клеток азотобактера при помощи других бактерий — явление, которое, само собой разумеется, не имеет никакого отношения к изучению нашей проблемы.

Наши критические замечания были напечатаны в обзоре, опубликованном в «Zentralbl. f. Bakteriologie» (см. статью XV).

Они имели следствием обмен письмами между г-ном Бэрком и мной. Совершенно чистосердечно этот ученый признал справедливость моей критики. Он мне писал 18 апреля 1938 г.:

«В течение года мы убедились, что загрязнение культур наблюдалось в большинстве случаев тогда, когда мы в наших опытах получали большие количества выделяемого аммиака. Это находится в полном согласии с Вашими замечаниями, подтверждая критику нашей работы, данную Вами в Вашей статье. В связи с этим позвольте нам выразить наше восхищение перед уверенностью, искусством и тонкостью, с которыми Вы обосновали свою точку зрения!»         щ

Этот случай заслуживает быть отмеченным, как тот случай, когда химик сталкивается с трудностями в получении достоверно чистых культур, необходимых ему для биохимического изучения. Обычно думают, что цель достигнута, когда капля исследуемой культуры не вызывает помутнения в мясном бульоне или в пептонной воде.

Мы уже неоднократно настаивали (см. часть третью и седьмую) на недостаточности подобного рода проб, которые не всегда гарантируют очищение культуры вплоть до последнего латентного зародыша. Единственный способ избежать в дальнейшем неприятностей, способ, который надежен и не обманывает,— это применять упорный микроскопический контроль на протяжении всего времени проведения опытов. Кроме того, очевидно, что даже при условии достаточной осведомленности химика в микроскопической технике, контроль может считаться полностью эффективным лишь в том случае, если контролирующий в совершенстве знаком с морфологическими особенностями вида.

В 1939 г. те же авторы, Бэрк и Хорнер, снова начинают заниматься тем же самым вопросом в следующем плане они ставят своей задачей выяснить, какое вещество клетки разлагается и выделяется в окружающую среду в течение роста и во время автолиза клеток. По их наблюдениям, растворимый азот появляется в культурах уже в возрасте 1—2 дней, составляя самое меньшее от 8 до 10% общего количества фиксированного азота. Что касается 1—3-недельных культур, то в этом случае отношение иногда возрастает до 50—70% общего азота (?). Большая часть этих растворимых веществ образуется в результате автолиза клеток, но авторы пытаются считать часть растворимого азота в молодых культурах за прижизненное выделение нормальных клеток (?).

«Наша более ранняя работа,— говорят они,— должна считаться теперь хотя и не во всех деталях, но в общем правильно оцененной Виноградским в его критической статье, как объясняющаяся частичным загрязнением наших культур». Исследование вопроса было вновь начато авторами со всеми предосторожностями, необходимыми для работы с чистыми культурами. Признаком чистоты последних неизменно считалось отсутствие роста в мясо-пептонном бульоне и в бульоне с прибавлением аспарагина при заражении их каплей культуры. Упомянутые ученые на этот раз все же убедились, что азотобактер неспособен разрушать органические азотсодержащие питательные вещества. Таким образом, основанный на этой предполагавшейся ими ранее способности азотобактера, аргумент в пользу дезаминирования азота клеток утрачивал свое значение.

Новые опыты, более тщательно контролируемые, показали бы им, что количество выделяемого аммиака было ими сильно преувеличено за счет работы многочисленных «спутников» азотобактера. Некоторые из этих спутников оказались бы, действительно, способными вызывать дезами- нирование азота клеток азотобактера в пределах до 50% его общего количества. На этот раз, однако, максимум обычно достигал не более 8— 12%. Считая проведенный опыт безупречным в смысле контроля над чистотой культур, можно было бы прийти к выводу, что уменьшенное количество продукции аммиака могло бы способствовать сближению двух противоположных точек зрения, если бы авторы снова не настаивали на том, что выделяемый аммиак полностью образуется вследствие разложения азота клеток, и что главным фактором, обусловливающим этот процесс, является истощение углеродного питания, т. е. глюкозы в их опытах.

В статье, в которой Бэрк излагает свои взгляды на биохимизм азот- фиксации, он возвращается к критике теории «промежуточного аммиака», так же как и других теорий, основанных на получении различных внеклеточных веществ, обнаруживаемых в культурах. Фиксация, в истинном смысле этого слова (первый этап), не отделяется им больше физически и химически от метаболизма (второй этап). Необходимо, говорит он, придерживаться самой суровой логики, чтобы избежать многочисленных источников ошибок, которые вытекают из того, что нормальный метаболизм чрезвычайно усложняет изучение процесса фиксации азота. Чтобы разделить два явления (первый и второй этапы), рекомендуется семь «критериев», основанных на самом тщательном сравнительном изучении питания азотобактера за счет связанного азота, с одной стороны, и за счет молекулярного—с другой.

Эти семь «критериев» представляли собой программу изучения условий азотфиксации, однако без указания специального метода, который позволил бы вплотную заняться исследованием механизма фиксации, сущность которого так стремились раскрыть. Я не мог позволить себе такой широкой постановки работ к концу моих экспериментальных исследований» Я скорее предполагал, что должен продолжать углубляться в раз избранном направлении, разрабатывая количественный или полуколичественный метод, который способствовал бы получению прямого доказательства, что аммиак, выделяемый культурамрг азотобактера, происходит из воздуха. Этот единственный результат, думал я, означал бы более реальное продвижение вперед в области изучения этой проблемы, чем чисто теоретические исследования Бэрка относительно гипотетических энзимов, вызывающих процесс азотфиксации — азотазы и нитрогеназы

Я надеялся, что этого результата можно достичь, устанавливая баланс азота в культурах при помощи трех определёйий: определения общего количества фиксированного азота, азота, выделяемого в форме аммиака, и, наконец, остаточного азота. Очевидно, что если дело идет только о дез- аминировании, то сумма второго и третьего определения должна равняться количеству исходного или быть ниже его. Если же она его значительно превосходит, то откуда можно было бы почерпнуть этот азот, как не из- атмосферных запасов?

Можно было предвидеть необходимые для этой работы многочисленные и трудоемкие манипуляции по «собиранию» небольших количеств выделяемого аммиака. Это было нелегко осуществить, учитывая все трудности и волнения, которые принесли военные годы и вторжение немцев.

 Будучи вынужденным, по этим соображениям, принять, по возможности, наиболее простую методику, я выбрал метод самопроизвольной перегонки аммиака , описанный в нашей последней статье XVIII. Очевидно, что этот метод, в достаточной мере примитивный, неизбежно ведет к большим потерям, так что, пользуясь им, можно быть уверенным в учете лишь какой-то части выделяемого аммиака, не зная, какой именно. Но если дело идет лишь об установлении заметного излишка аммиака, то такая ошибка делает результат, по меньшей мере, лишь более достоверным. Что касается поглощения аммиака из воздуха, то возможность этого исключалась, так как пластинки все время сохраняли щелочную реакцию. Прибавим, что возможность определять аммиак по мере его выделения в течение долгого времени, не повреждая культур, была одним из преимуществ нашей методики.

Результаты проведенных опытов были подытожены мною в последней статье (XVIII), написанной в 1941 г., в особенно тревожное время, когда было трудно сохранить ясность и спокойствие мыслей, необходимые для научной работы. Этим объясняются некоторые недочеты, допущенные мной при обсуждении полученных результатов и при формулировке выводов. Ввиду этого я был вынужден их пересмотреть, и они появляются в этом издании в исправленном виде. Я прошу читателя считать именно их за истинное выражение моих взглядов на экспериментальные данные, полученные мною в результате этих последних моих изысканий.

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ