О РАЗРУШЕНИИ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ В ПОЧВЕ

С.Н. Виноградский

Смотрите также:

Биография Виноградского

Микробиология

Почва и почвообразование

Почвоведение. Типы почв

Геоботаника

 Биографии биологов, почвоведов

Эволюция

Биология

Эволюция биосферы

Геология

Основы геологии

Геолог Ферсман

Геохимия - химия земли

Гидрогеохимия. Химия воды

Минералогия

Химия почвы

Круговорот атомов в природе

Книги Докучаева

Происхождение жизни

Вернадский. Биосфера

Дифференцирование штаммов

Нет ничего легче, как воспроизвести на новых чашках эти зоны или окрашенные пятна со всеми их признаками. Выбирают место, из которого хотят сделать пересев, и притрагиваются к нему концом платиновой проволочки или, еще лучше, тонко оттянутой стеклянной палочкой. Легкого прикосновения достаточно для пересева. На новой чашке делаются посевы штрихами. Часто случается, что в результате одного посева вырастают две разные зоны.

Тогда их можно разделить при помощи тех же манипуляций, делая пересевы из мест, которые кажутся наиболее характерными. Интересно, что окрашенные зоны противостоят вторжению зон другого цвета. Фиг. 20 на табл. XXI изображает случай подобного рода. Можно видеть зеленое пятно, которое полностью окружено желтой зоной, нигде его не покрывшей. На фиг. 16 и 21 табл. XXI видно розовое пятно, образовавшееся в результате пересева, но оно окружено желтым пятном, которое быстро распространяется на свободных участках бумаги. На фиг. 13 табл. XXI видно разделение двух зеленых оттенков. Наконец, на фиг. 17 и 22 табл. XXI воспроизведено состязание светложелтой зоны и черной.

Достаточно 3—4 пересевов, чтобы характер культуры установился по следующим признакам: 1) микроскопическая картина, 2) окраска, сообщаемая бумаге, 3) изменение бумаги.

В других случаях стабилизация признаков, которая, конечно, свидетельствует об очищении, бывает менее ясно выражена.

Имеется, наконец, и третий случай, когда смесь форм представляется неразделяемой. При применении нашего метода, к счастью, такие случаи встречаются относительно редко, и находятся все-таки средства определить состав окрашенной колонии.

Методы окраски и морфологические исследования

Уже Гэтчинсон и Клэйтон заметили, что открытый ими микроб с трудом окрашивается основными красками.

Это наблюдение совершенно правильно. Оно может быть распространено на всю изучаемую нами группу. Обычно основные краски мало пригодны. Окраска по Граму не удается. Окраска фуксином Циля не дает хороших препаратов.

Мы воспользовались методом, основанным на применении двух красок: одной кислой — эритрозина, служащего в известной мере протравой, и затем, водного генцианвиолета. Эта методика уже раньше зарекомендовала себя как дающая хороший красящий эффект. Она имеет еще то преимущество, что волокна остаются почти бесцветными, что дает возможность наблюдать размещение на них микробов.

Поступают следующим образом: отрывают маленький кусочек бумаги с чашки, насколько возможно разрывают его на части при помощи иголки в капельке воды на покровном стекле. Распределяют волокна по всей поверхности стекла, высушивают, фиксируют абсолютным спиртом, который поджигают, и задувают огонь, как только спирт загорается. Покрывают стекло 1%-ным раствором эритрозина extra в 5%-ной карболовой воде. Через несколько минут промывают стекло, держа его пинцетом в стакане с водой несколько секунд; наконец, окрашивают слабым водным раствором генцианвиолета в течение 5—10 минут.

Молодые клетки окрашиваются очень интенсивно, обычно средняя часть клетки сильнее, чем концы, причем в самом центре видно нечто, напоминающее хроматиновое ядро. Такая подробность характерна для «большинства микробов этой группы.

По мере старения окраска становится все более слабой, и увеличение продолжительности окрашивания не помогает. Наконец, старые клетки воспринимают окраску лишь очень слабо, клетки же в состоянии автолиза едва окрашиваются.

Наблюдения в висячей капле над живыми клетками не удаются не только потому, что они очень тонкие и исключительно нежные, но особенно вследствие способа их питания нерастворимым веществом. Единственный способ проследить их развитие — это исследовать микроскопически волокна бумаги, покрытые микробами, в различные периоды развития культуры: 1) в самом начале, как только появляется характерное пятно, .2) через десять дней и, наконец, 3; еще дней через пятнадцать.

Первое наблюдение обнаруживает наиболее характерные формы, еще без симптомов дегенерации. При втором уже можно видеть примесь форм слегка вздутых или в начальной стадии автолиза. При третьем наблюдении автолизированные формы преобладают, а еще через несколько времени и эти клетки исчезают иногда совершенно. Культура делается неузнаваемой для того, кто не проследил истории ее развития. Именно по этому плану были выполнены морфологические наблюдения, изложенные ниже.

Многие формы вибрионов обладают очень энергичной подвижностью, которую легко видеть на темном фоне. Окраска жгутов удается с трудом. Ее можно добиться, применяя метод Мюира: протрава состоит из 5 мл насыщенного раствора калиевых квасцов, 2 мл насыщенного раствора хлорной ртути и 2 мл 20%-ного раствора таннина. После промывания окрашивают 1%-ным эритрозином на 5%-ной карболовой воде, промывают и окрашивают карболовым генцианвиолетом. Окраска жгутиков получается отчетливой, но обычно клетки со жгутиками встречаются редко.

Химические методы

«По мере того как мы углубляемся в область химии целлюлозы, она нам представляется все более неисследованной, и понимание реакций и природы дериватов становится менее и менее ясным. Это особенно верно по отношению к окислению целлюлозы и к основному продукту окисления, названному Витцем, открывшим его, оксицел- л ю л о з о й. Весьма сомнительно, что мы в этом случае имеем дело с определенным продуктом, всегда одним и тем же. В самом деле, бесчисленные продукты, которые получают при помощи различных методов окисления, различаются и по своим свойствам и по своему составу, хотя в некоторых отношениях они и сходны». «Исключительно трудно определить характер оксицеллюлозы и дать безупречную характеристику ее природы и ее возможного строения».

Таким образом начинается глава «Об окислении целлюлозы» в новом учебнике по химии целлюлозы Эмиля Хейсера1.

Этой цитаты достаточно, чтобы получить ясное представление о тех затруднениях, с которыми сталкивается микробиолог, приступая к этой теме.

Чтобы составить себе представление о биологическом окислении, необходимо вспомнить основные факты, приводимые в учебниках по этому вопросу , а также теоретические положения, которые служат для их объяснения.

Если рассматривать целлюлозу с точки зрения ее химической структуры как первичный поливалентный спирт, то следует ожидать, что первым результатом окисления будет превращение группы СН2—ОН в группу ОНО, и далее — появление карбоксильной группы, образовавшейся за счет той или иной спиртовой группы или за счет альдегидной группы, возникшей в результате первичного окисления. Так как молекула целлюлозы комплексная, то образуются различные комбинации, имеющие, с одной стороны, свойства альдегидоспиртов, как сахара, а с другой, кислотные свойства, обусловленные присутствием группы СООН.

Что касается реакции альдегидной группы, то восстановительная способность появляется уже после умеренного гидролиза в случае гидроцеллюлозы А. Жирара. Она усиливается у оксицеллюлозы, приготовленной при помощи сильных окислителей, таких, как гипохлориды, азотная кислота, перманганат и др. Она вообще возрастает с увеличением степени окисления.

Наличие карбоксильной группы было точно установлено в молекуле оксицеллюлозы безупречными химическими методами. Именно кислотным свойствам следует приписать растворимость оксицеллюлозы в слабых щелочах. При растворении оксицеллюлозы раствор приобретает золо- тисто-желтую окраску, что считается характерным признаком для окисленных волокон. Эти последние заметно теряют в весе после обработки разбавленными щелочами, тогда как целые волокна в тех же условиях не теряют в весе или теряют меньше.

Именно кислотному характеру оксицеллюлозы приписывают то очень характерное свойство, что она удерживает основные краски — метилено- вый синий и сафранин — и не воспринимает кислых красок. Легкий способ отличить волокна, содержащие оксицеллюлозу от волокон, незатронутых окислением, состоит в следующем: в разбавленный раствор метилено- вого синего, не превышающий 0,5 %, погружают волокна на 20 минут, а затем промывают 24 часа в холодной воде. Волокна, содержащие оксицеллю- лозу, удерживают синюю окраску, а целые волокна обесцвечиваются До бледноголубого оттенка. Обратное получается с кислыми красками, например, с ксилидиновым красным. Целые волокна удерживают розовую окраску после промывания, а окисленные совершенно обесцвечиваются.

Последнее замечание, которое нужно сделать, касается хода процесса окисления, который неизменно наблюдается во всех опытах: следует иметь в виду, что реакция окисления, вызванная любым окислителем, не приводит к образованию однородного продукта. Она идет постепенно, образуя продукт, содержащий часть нетронутой целлюлозы, тогда как другая часть находится в состоянии распада более глубокого, чем намеревались получить.

Мы считаем возможным ограничиться приведенными данными по химии целлюлозы, как бы ни были они неполны, так как они достаточны для того, чтобы оправдать выбор тех проб, которым мы подвергаем волокна наших культур. Эти пробы следующие: 1) проба на восстановление жидкости Фелинга, 2) действие разбавленных щелочей, 3) окрашивание.

Первая проба в применении к волокнистому материалу может быть только количественной: определяют «медное число» — процент меди, освобожденной в кипящей фелинговой жидкости. Здесь мы встречаем затруднения, так как обычный метод, которым мы располагаем, метод Швальбе, не применим в нашем случае, как очень сложный и, кроме того, требующий много материала. Мысль применить в нашем случае метод Бертрана позволила преодолеть эти затруднения.

Нужно только дольше кипятить, добавив больше воды и меньше реактивов, пользоваться для фильтрования широкой воронкой, которая может вместить несколько десятых грамма бумажной массы, не затыкая асбестового фильтра, и, наконец, пользоваться более разбавленным раствором перманганата, чем при определении Сахаров. Метод оказался удобным и достаточно чувствительным, если взять 10 + 10 мл реактивов А и В, добавить 50 мл воды, кипятить 5 минут и титровать раствором перманганата 3 г на 1000 мл. Разумеется, производят холостое титрование, так как мы имеем дело с очень маленькими количествами. Пользуясь этой методикой, мы определяли восстановительную способность применяемого нами целлюлозного материала и нашли:

Медное число

Гидроцеллюлоза (различного приготовления)                3,4 до 5,0

Гигроскопическая вата                   0,4 — 0,5

Фильтр Durieux «Super»                 0,8

Фильтр Durieux N 111 (обработанный кислотами)                1,0 — 1,6

Бумажная ткань типа перкаль                   Нет

Можно видеть, что используемая для пластинок бумага уже содержит определяемое и мало изменяющееся количество оксицеллюлозы. Следовательно, восстановительная способность может быть определена только по разности между конечным и начальным значением, что является тонкой работой, особенно в случае слабой восстановительной способности.

Метод с хлопчатобумажными тканями позволяет избегать этих затруднений и представляет упомянутые уже преимущества для химических исследований. Добавим, что с ткани легко экстрагировать образовавшиеся продукты окисления, а это дает возможность определить количественные соотношения между остающейся чистой целлюлозой и этими продуктами, а также исследовать их отдельно.

Что касается анализа культур на чашках с кремнекислым гелем, то употребление минерального геля не приносит никаких осложнений.

В случае видов, не обладающих способностью лизировать волокна, культивируемых на бумаге и всегда оставляющих неразложенный остаток, следует поступать следующим образом: на поверхность геля наливают воду небольшими порциями и слегка покачивают чашку. Кружок бумаги превращается во всплывающую массу, образуя большие хлопья, которые без потерь можно перенести в стакан. В результате тщательного отмывания поверхность геля может быть совершенно освобождена от остатков бумажной массы.

Работа упрощается, если пользоваться хлопчатобумажной тканью. Последнюю можно снять с поверхности геля пинцетом с острыми концами.

Культура на чашке в конечном счете разделяется на три или четыре части:

1)        волокна, с которыми производят вышеописанные пробы;

2)        водный экстракт из них, в котором определяют рН, азот, летучие' продукты и пр.;

3)        высушенный кремнекислый гель, взвешенный, растертый в мельчайший порошок, водный экстракт из которого служит для тех же определений .

К содержанию книги: Сергей Николаевич ВИНОГРАДСКИЙ - МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ. ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ